血小板生长因子对新生鼠缺血缺氧性脑损伤保护作用

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1、血小板生长因子对新生鼠缺血缺氧性脑损伤保护作用【摘要】目的探讨血小板生长因子(PDGF)对新生鼠缺血缺氧性脑损伤(HIBD)的保护作用。方法7日龄ethodsThisstudyconsistedof72ANCOULTERFC500流式细胞仪，LD52A离心机(北京医用离心机厂制造)，日本OLYMPUS荧光显微镜，200目不锈钢细胞筛。　　1.2实验方法　　1.2.1新生大鼠HIBD模型制备治疗组和对照组制备HIBD模型。取7日龄L/kg麻醉后，仰卧固定于手术板上，用安尔碘局部消毒皮肤。于右侧颈动脉区作一长约1cm切口，逐层分离皮下组织，暴露并游离右侧颈总动脉，0号线结

2、扎右颈总动脉，一次性缝合线缝合切口。待术后苏醒将大鼠放入自制的新生大鼠缺氧装置中，以2L/min的流量输入体积分数0.08O2+体积分数0.92N2的混合气体，环境温度为36～37℃,低氧处理2h后取出返回母鼠身边继续喂哺。假手术组仅分离右侧颈总动脉，不予结扎及低氧处理。　　1.2.2干预措施治疗组于模型建立后30min内腹腔注射PDGFBB50ng/kg，假手术组和对照组在相同时间腹腔注射等量生理盐水。　　1.2.3标本的制备3组大鼠分别于术后12、24、72h以100g/L水合氯醛过度麻醉处死，断头，取右侧大脑半球脑组织用生理盐水洗去表面血污，无菌剪刀将其剪成1m

3、m3小块，放到200目(相当于孔径80μm)不锈钢细胞筛网上，用无菌玻璃试管挤压脑组织块，PBS液轻轻吹打细胞网筛，滤过液再经40μm细胞筛过滤，即成单细胞悬液。单细胞悬液再经过PBS液洗涤1～2次,取1mL细胞(密度5×108/L～1×109/L)用FITC和PI双染(方法参照AnnexinⅤ试剂盒说明书),40g/L多聚甲醛2～3mL固定，4℃避光保存。　　1.2.4细胞凋亡检测采用流式细胞仪检测法:将40g/L多聚甲醛固定的单细胞悬液用冷的PBS液洗1～2次，用PBS液使细胞悬浮，即可上流式细胞仪检测细胞凋亡率,计数104个细胞。　　1.2.5统计学处理数据以均数

4、±标准差表示。用SPSS12.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　假手术组大鼠各时间点神经细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)，术后12、24、72h对照组和治疗组神经细胞凋亡率均逐渐增加，差异有显著意义(F=130.35、78.83，q=5.07～19.46，P<0.01)。各时间点对照组和治疗组较假手术组脑细胞凋亡率显著增加，治疗组较对照组脑细胞凋亡率显著减少，差异有显著意义(F=39.01～194.20，q=3.08～16.51，P<0.01)。见表1。表1各组术后不同时间右侧大脑半

5、球神经细胞凋亡率　　3讨论　　HIBD极期对症支持治疗及随后的脑细胞代谢激活剂、促进神经纤维修复药物的应用已达成共识。针对发病机制的各个环节，国内外学者对HIBD的治疗作了大量的研究，如基因治疗、神经干细胞移植、氧自由基清除剂、钙离子通道阻滞剂和细胞因子的应用等，都尚在探索研究阶段。近年来，很多研究支持PDGF具有神经保护作用[25]。　　3.1HIBD与细胞凋亡　　ZHANG等[6]研究显示，缺血低氧后不成熟大脑室管膜下神经细胞发生不同程度的损伤。神经元和少突细胞祖细胞较神经干细胞和星形胶质细胞受损更为严重。临床及动物实验证明缺血低氧可引发细胞凋亡。细胞凋亡在HIB

6、D中呈动态变化过程。神经细胞急性坏死的同时，凋亡即已发生，在缺血低氧后4d，细胞急性坏死减少或停止，凋亡仍然发生，直至1～2周以后[7]。细胞凋亡时细胞膜磷脂酰丝氨酸(ps)外翻，ps与荧光探针特异性结合，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测凋亡细胞。　　3.2PDGF的神经保护作用　　PDGF是由多种细胞产生能刺激成纤维细胞、平滑肌细胞、胶质细胞等增生的多肽，具有广泛的生理活性。它是由A、B两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，包括PDGFAA、PDGFBB、PDGFAB等3种形式，其相对分子质量为2.8万～3.5万。PDGF生物学特征主要有分裂效应、缩血

7、管活性和趋化活性，它以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。PDGF受体由α、β两种亚基构成3种二聚体，PDGF发挥作用必须与靶细胞上的受体相结合。近年来的研究结果发现，PDGF及其受体在中枢神经系统广泛表达，它参与神经系统的发育、成熟等过程，在不同发育时期的神经元、神经胶质细胞均有表达，PDGF在神经变性、脑缺血缺氧性损伤等疾病中发挥重要的作用。PDGF及其受体在神经系统的表达受多种因素调节，在损伤、缺血低氧、炎症时表达增多[811]。OHNO等[9]研究结果显示，HIBD诱导神经元的PDGFBB和β受体水平迅速升高，提示PDGFBB分子