未甲基化cpg寡聚脱氧核苷酸对小鼠脾细胞产生免疫球蛋白e的抑制作用

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1、未甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对小鼠脾细胞产生免疫球蛋白E的抑制作用：谢海瑞，沈二霞，李文益，吴长有【摘要】【目的】探讨未甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸（CpGODN）在体外对小鼠脾细胞和纯化B细胞产生免疫球蛋白E(IgE)的作用及其机制。【方法】在体外，小鼠脾淋巴细胞和纯化B细胞与白细胞介素4（IL-4）+抗CD40单克隆抗体（anti-CD40）在CpGODN存在或不存在的条件下刺激3d或7d后，用酶联免疫吸附试验法检测IgE的水平，用流式细胞仪检测CD19阳性B细胞的分裂及活化情况。【结果】CpGODN呈剂量及时间依赖性地

2、抑制由IL-4+anti-CD40诱导的小鼠脾细胞IgE的产生，anti-IFN-γmAb及anti-IL-12mAb不能完全拮抗CpGODN对IgE产生的抑制作用。同样地，CpGODN抑制小鼠纯化B细胞IgE的产生。进一步分析结果表明，CpGODN促进B细胞活化及共刺激分子CD80的表达，但抑制B细胞分裂。【结论】CpGODN直接作用于B细胞而发挥对IgE的抑制作用，该研究为基础和临床研究提供科学理论依据。【关键词】CpGODN；IgE；脾细胞；纯化B细胞；小鼠近来研究发现，未甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸（CpGoligo

3、deoxynucleotide,CpGODN）治疗变态反应性疾病取得了显著疗效[1-4]。动物哮喘模型已证实，CpGODN既可以改善也可以预防变态反应急性发作时所导致的气道高反应性、黏液异常分泌、平滑肌痉挛及气道内嗜酸细胞浸润等症状[1-3]，甚至可以阻止慢性哮喘鼠的气道重塑[4]。最近亦有报道，用豚草-CpGODN耦联抗原在豚草生长季节治疗过敏性鼻炎取得了一定的效果[5]。目前，尽管CpGODN在激活免疫应答方面的作用已经明确，但其作用机理仍不清楚。有研究认为，CpGODN是通过直接或间接激活多种免疫细胞，诱导产生Th1型

4、细胞因子，如IL-12、IFN-γ和TNF-α等，从而抑制Th2类细胞因子IL-4和IL-5的产生，进一步抑制B细胞产生IgE，抑制嗜酸细胞聚集活化[6,7]。但亦有研究发现，去除IL-12或IFN-γ，CpGODN仍然可以抑制变态反应的发生[8，9]。为此，我们试图研究CpGODN在细胞群体水平、单个细胞水平上对B细胞产生IgE的作用。结果表明，CpGODN可通过细胞因子网络以外的其他途径来抑制IgE的产生，该结果对CpGODN的生物学功能有了新的认识，为临床研究提供基础实验依据。1材料和方法1.1材料正常雌性6～8周龄B

5、LAB/c小鼠18只，购自中山大学实验动物中心。CpGODN1826(5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′)，由上海生工生物工程公司合成，全链硫代磷酸化修饰，PAGE纯化产品。CFSE购自美国Molecularprobes公司。CD19MicroBeads购自德国Miltenyi公司。Anti-CD40、anti-IFN-γmAb、anti-IL-12mAb,PE标记的抗CD80单克隆抗体（PE-anti-CD80）及抗CD25单克隆抗体（PE-anti-CD25）、FITC标记的抗CD69单克隆抗体（FIT

6、C-anti-CD69）、APC标记的抗CD19单克隆抗体（APC-anti-CD19）以及相匹配的对照抗体、抗小鼠IgE的ELISA检测试剂盒均购自美国BD公司（BD/Pharmingen）。IL-4、RPMI1640培养液和Hank′s液购自美国GIBCO公司。96或48孔平底培养板及流式细胞仪(Aria)为BD公司产品。ELx800型酶标仪为美国BIO-TEK公司产品。96孔平底ELISA板为美国Greiner公司产品。1.2方法1.2.1细胞制备处死小鼠取脾脏，制备单个细胞悬液，以600×g离心8min，洗涤细胞2次

7、。加入红细胞裂解液裂解红细胞，用Hank′s液洗涤2次后，将细胞悬浮于RPMI1640完全培养液(含100mL/L灭活胎牛血清、50g/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素及100mg/L链霉素)中，计数细胞并调整细胞浓度至4×106/L。1.2.2细胞纯化如上制备小鼠脾细胞悬液，按Miltenyi公司说明书叙述的方法加入抗CD19+B细胞生物素磁珠，将CD19+B细胞从小鼠脾细胞中分离出来，然后将其悬浮于RPMI1640完全培养液中，并调整细胞浓度至5×105cells/mL。经由FITC-CD19抗生物素磁珠染色，流式细胞

8、仪分析证明CD19+B细胞纯度是91%~95%。1.2.3CFSE标记将小鼠脾细胞用含0.1%灭活牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐（PBS）缓冲液洗涤并悬浮，细胞浓度为10×106cells/mL。CFSE按1∶2000比例加入细胞悬液中，其终浓度为10μmol/L，于37℃环境中培养10m