新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的实验研究

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1、新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的实验研究：陈钟，陈瑞新，丁义涛，田鹏鹏，周卉【摘要】目的：探讨猪肝细胞为基础的新型生物人工肝（BAL）系统体外灌流后及治疗急性肝衰竭（ALF）犬后猪内源性逆转录病毒（PERV）的传播。方法：构建新型BAL，应用BAL进行体外灌流6h。采用门腔分流及胆总管结扎切断术建立犬ALF模型，应用BAL治疗ALF犬6h。采用PCR检测灌流前猪细胞中PERV原病毒DNA和猪mtDNA，采用RT-PCR检测灌流前后中空纤维管内腔循环液和治疗前后犬血清PERVRNA。结果：猪细胞可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA，灌流前后中空纤维管内腔循环

2、液和犬血清PERVRNA均为阴性。结论：猪肝细胞为基础的新型BAL体外灌流和用于ALF犬治疗6h后未发现PERV传播。【关键词】肝功能衰竭；生物人工肝系统；猪内源性逆转录病毒；逆转录-聚合酶链反应[Abstract]Objective:Tostudythetransmissionofporcineendogenousretrovirusafterperfusioninvitroandtreatmentforacuteliverfailurecaninesusingbioartificialliversystembasedonporcinehepatocytes.Methods：Thenov

3、elbioartificialliversystem(BAL)for6h.ALFonbileductligationandtransection.BALofcaninespre-circulationtopost-circulation.Results：Theresultsshoentof6hforALFcaninesusingthenovelBALsystembasedonporcinehepatocyte.[Keyent;Bioartificialliversystem;Porcineendogenousretrovirus;Reveretranscriptasepolymerasec

4、hainreaction近年来生物人工肝（Bioartificalliver,BAL）成为人工肝研究的重点，有望成为急性肝衰竭治疗的有效手段[1]。由于人肝细胞的短缺，猪肝细胞因其广泛、功能与人肝细胞相近，成为BAL较理想的肝细胞[2]。但猪基因组中整合的内源性逆转录病毒（porcineendogenousretrovirus,PERV）的释放致人体细胞的感染可能性是猪肝细胞应用中面临的一大问题。我们在成功构建新型BAL后，通过体内外循环灌流研究PERV传播的可能性，为猪肝细胞为基础的BAL应用的安全性提供依据。1材料与方法1.1主要试剂与仪器BIOLIVA3A中空纤维管生物反应器（购自香

5、港细胞生物有限公司）。RPMI1640培养基、新生牛血清购自Gibco公司。PCR主要试剂：蛋白酶K、RNAPCRKit(AMV)Ver2.1和MarkerDL2000均购自TaKaRa公司；扩增仪为GeneAmpPCRSystem2400（PerkinElmer）；凝胶成像仪为上海四星生物技术有限公司生产，型号SX-100。1.2方法1.2.1猪肝细胞的制备及活率检测中国实验用小型猪（n=5），雌雄不限，体重2～4kg。采用原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞[2]。台盼蓝法检测细胞活率。取肝细胞以5×106个/ml接种到含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中以5×107/ml进行限

6、制贴壁、旋转培养12h，制备球形聚集体肝细胞循环液。1.2.2急性肝衰竭（acuteliverfailure,ALF）犬模型的制作中国杂种犬5只，体重10～15kg，雌雄不限,由南通大学实验动物中心提供。采用门腔静脉端-侧分流及胆总管结扎切断术建模[3]。1.2.3新型BAL的构建和体内外循环灌流采用BIOLIVA3A中空纤维管生物反应器构建新型BAL[4]。中空纤维管膜孔径200nm，截流分子质量为70kD。新型BAL由闭合循环的细胞环路和血路两部分组成。细胞环路容量为250ml。将旋转培养后的猪肝细胞悬液（含1×1010猪肝细胞）置于中空纤维管外腔，循环速度20ml/min，持续通入氧

7、气流量2L/min。体外循环灌流时血路采用RPMI1640培养基250ml流经中空纤维管内腔进行循环。体内灌流时，将ALF犬的股动脉血通过BAL的中空纤维管内腔循环到犬股静脉内，循环速度30ml/min。保持生物反应器于37.5℃，循环时间6h。体内外循环灌流实验分别进行5次。1.2.4检测指标①灌流前取球体培养的中国实验用小型猪肝细胞，用PCR扩增检测肝细胞PERV原病毒DNA和猪线粒体DNA（mitochondria