核酶在基因治疗中的研究进展论文

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1、核酶在基因治疗中的研究进展论文关键词：核酶；基因治疗摘要：80年代初，由美国科学家Cech和Altman发现了核酶（Ribozyme）,随着人类基因工程研究的深入，部分临床实验室工作者和基础科学研究人员开始注意到Ribozym在基因治疗中的应用潜力。近几年来，人们利用Ribozyme可以特异性地切割靶RNA序列的特点，设计适合的Ribozyme阻断特定基因的表达，相继对艾滋病、肿瘤、生殖系统疾病、肝炎、白血病、移植排斥反应等疾病进行了大量研究。试验结果表明Ribozyme作为基因治疗的一种方法有着广阔的应用前景和极大的临床实用价值。AdvanceinStudyofGeneTher

2、apybyRibozyme核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列。迄今，人们发现的核酶有六种类型.freelerbindingsite）是一个18核苷酸序列和tRNA的3′末端互补。实验分析展示这段序列是一段高度保守序列，Amer等［2］针对这段序列设计了锤头状核酶，抑制了HIV-1在体内的复制，5′端引导序列是一个诱导区域，对所有HIVRNA的转录和翻译都十分重要。通常在此位置剪切产生5′片段，可竞争抑制HIV的复制和转录。细胞系中，特异性地切割HIV-1RNA长末端重复序列（Longterminalrepeat，LTR）的U5

3、区，结果显示此三种核酶具有抗HIV-1ⅢB的作用，且HR112和RZ119有极强的抗HIV-1感染作用。2核酶在抗生殖道感染的研究进展尖锐湿疣（Condyiomaaccuminatum）又称生殖道疣，是一种由人乳头瘤病毒（HPV）引起的性传播疾病。近30年来，其发病率持续增高，已鉴定的HPV有70多型，其中与尖锐湿疣最为相关的是HPV6、11型，其HPV早期基因组（E1、E2、E4、E5、E6和E7基因）的转录是HPV在宿主细胞中增殖的关键步骤。转录的主要调节系统在于上游调控区（LCR）中，调控蛋白是E2蛋白，为45～48KD，以二聚体形式结合于DNA，全长E2蛋白是一个典型的反

4、式激活蛋白，它能以二聚体的活性形式特异的结合于上游调控区的E2结合位点AC6GGT，可使HPV早期基因组的转录水平提高20～100倍。此外E1是HPVDNA的复制蛋白，复制结构功能域位于蛋白的末端，E1功能的实现是通过与上游调控区（URR）中的复制起点（0rigin,Ori）内跨越nt1位，长18bp的一段反向重复结构结合后发挥ATP酶依赖的DNA解旋酶作用而开始从ori起始整个HPV基因组DNA复制的。E6基因能与抑癌基因p53的产物及细胞内的E6相关蛋白（E6-AP）结合而导致p53基因降解失活，E7蛋白与Rb抑癌基因的结合影响Rb与细胞转录因子E2F结合，使E2F与Rb分离

5、而影响Rb表达。Huang等针对HPV6a6b、11E1mRNA的3′端和E2mRNA的5′端（两个起始密码子AUG之间的区域）中的保守序列，分别设计合成具有反义抑制和切割活性的锤头状核酶，进行体外切割实验，筛选出具有高效切割活性的2～3种核酶，分别合成Ribozyme的基因串联后形成多功能Ribozyme基因，并合成只具有反义作用的反义基因作对照。宫颈瘤是常见的人类生殖道肿瘤，研究证实宫颈瘤组织及其细胞系中，一般都有HPVE6/E7基因的高水平表达，HPVE6/E7蛋白可通过其N-端38个氨基酸与肿瘤抑制基因产物RB蛋白结合而使其功能失活，导致细胞周期调控的紊乱和细胞染色体的不

6、稳定。Alvarez等［10］针对HPV16E6/E75端和3断设计出抗E6/E7的发夹状核酶RZ343和RZ523特异性切割E6、E7RNA片段，应用启动子RSV-LTR提高转录效率，通过钙-磷酸盐共沉淀法将pRSV-RZ523导入CV-1细胞糸中，斑点-印迹杂交法显示此核酶在CV-1细胞中高效表达，密度扫描结果显示表达水平约为9.0pmol/106个细胞，表达的活性核酶的量至少为50fmol/106个细胞，细胞连续培养4周后，细胞形态无明显改变，说明核酶的长期表达对细胞本身无明显的毒性影响。通过Rnase保护测定结果（ResultofRNaseprotectionassa

7、y）表明，在CV-1细胞中的E7RNA片段减少90%，有效抑制E7基因的表达。Chen等［11］分别针对核酸位点123nt、309nt、671nt设计三种锤头状核酶切割HPV-18E6/E7基因，核酶在靶位点进行杂交，比率为20：1，体外活性切割实验表明，三种核酶均有效抑制E6/E7基因转录，其中RZ309切割效率最高。Lu等［12］设计两种核酶，切割编码HPV-16E6/E7开放阅读框架（OpenreadingframesORF）的所有转录产物，切割位点为病毒基因链RNA上的1