核酶在基因治疗中的研究进展

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1、核酶在基因治疗中的研究进展关键词：核酶；基因治疗　　摘要：80年代初，由美国科学家Cech和Altman发现了核酶（Ribozyme）,随着人类基因工程研究的深入，部分临床实验室工作者和基础科学研究人员开始注意到Ribozym在基因治疗中的应用潜力。近几年来，人们利用Ribozyme可以特异性地切割靶RNA序列的特点，设计适合的Ribozyme阻断特定基因的表达，相继对艾滋病、肿瘤、生殖系统疾病、肝炎、白血病、移植排斥反应等疾病进行了大量研究。试验结果表明Ribozyme作为基因治疗的一种方法有着广阔的应用前景和极大的临床实用价值。　　　AdvanceinStu

2、dyofGeneTherapybyRibozyme　　核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列。迄今，人们发现的核酶有六种类型，即1类内含子、RNaseP、锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎核酶及VS核酶，但从结构上看主要分为两大类［1］：锤头状核酶和发夹状核酶。锤头状核酶长约30个核苷酸，由三个碱基配对的螺旋区、两个单链区和膨出的核苷酸构成。该酶可分为3个部分，中间是以单链形式存在的13个保守核苷酸和螺旋Ⅱ组成的催化核心，两侧的螺旋Ⅰ/Ⅲ为可变序列，共同组成特异性序列，决定核酶的特异性。发夹状核酶切割活性所需最小长

3、度为50个核苷酸，其中15个是必需的。该酶由4个螺旋区（H）和数个环状区（J）组成。螺旋Ⅰ、Ⅱ的主要功能是与靶序列结合，决定核酶切割部位的特异性，螺旋Ⅲ配对碱基及其3′端的未配对碱基均为切割活性所必需。核酶的作用原理为核酶的特异性序列通过互补碱基对形成识别并结合特异性靶RNA，根据这一特性可以人工设计针对某一RNA的核酶分子，破坏病毒转录产物而对机体无害，将针对多个位点的核酶序列串连成一个多靶位核酶分子可以大大提高切割效率，达到治疗目的。因为其独特的优点：（1）序列特异性；（2）不编码蛋白质，无免疫原性；（3）可以重复使用。使其在基因治疗领域中倍受青睐，其研究进

4、展也相当迅速。　　基因治疗是目前分子水平研究领域中的一个热点，即将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的基因,从而达到治疗目的。经过国内外科学家十余年的努力，基因治疗已从实验室研究阶段过渡到临床试用阶段，其治疗范围已从过去的单基因疾病扩大至多基因疾病，治疗病种涉及面广，目前成为临床治疗一种很有潜力的新方法。　　1　核酶在抗HIV中的研究进展　　HIV可分为HIV-1和HIV-2，至少可以编码9种蛋白，研究者从不同角度选择合适的靶基因。HIV的PBS（Primerbindingsite）是一个18核苷酸序列和tRNA的3′末端互补。实验分析展示这段序列是一段高

5、度保守序列，Amer等［2］针对这段序列设计了锤头状核酶，抑制了HIV-1在体内的复制，5′端引导序列是一个诱导区域，对所有HIVRNA的转录和翻译都十分重要。通常在此位置剪切产生5′片段，可竞争抑制HIV的复制和转录。细胞系中，特异性地切割HIV-1RNA长末端重复序列（Longterminalrepeat，LTR）的U5区，结果显示此三种核酶具有抗HIV-1ⅢB的作用，且HR112和RZ119有极强的抗HIV-1感染作用。　　2　核酶在抗生殖道感染的研究进展　　尖锐湿疣（Condyiomaaccuminatum）又称生殖道疣，是一种由人乳头瘤病毒（HPV）引

6、起的性传播疾病。近30年来，其发病率持续增高，已鉴定的HPV有70多型，其中与尖锐湿疣最为相关的是HPV6、11型，其HPV早期基因组（E1、E2、E4、E5、E6和E7基因）的转录是HPV在宿主细胞中增殖的关键步骤。转录的主要调节系统在于上游调控区（LCR）中，调控蛋白是E2蛋白，为45～48KD，以二聚体形式结合于DNA，全长E2蛋白是一个典型的反式激活蛋白，它能以二聚体的活性形式特异的结合于上游调控区的E2结合位点AC6GGT，可使HPV早期基因组的转录水平提高20～100倍。此外E1是HPVDNA的复制蛋白，复制结构功能域位于蛋白的末端，E1功能的实现是

7、通过与上游调控区（URR）中的复制起点（0rigin,Ori）内跨越nt1位，长18bp的一段反向重复结构结合后发挥ATP酶依赖的DNA解旋酶作用而开始从ori起始整个HPV基因组DNA复制的。E6基因能与抑癌基因p53的产物及细胞内的E6相关蛋白（E6-AP）结合而导致p53基因降解失活，E7蛋白与Rb抑癌基因的结合影响Rb与细胞转录因子E2F结合，使E2F与Rb分离而影响Rb表达。Huang等针对HPV6a6b、11E1mRNA的3′端和E2mRNA的5′端（两个起始密码子AUG之间的区域）中的保守序列，分别设计合成具有反义抑制和切割活性的锤头状核酶，进行体

8、外切割实验，筛选出具有高