基因治疗新药核酶的研究进展

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1、基因治疗新药核酶的研究进展核酶(ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子，可通过碱基配对特异性地与相应的RNA底物结合，在特定的位点切割底物RNA分子，是一类很有希望的基因功能阻断剂，被形象地称为“分子剪刀”.它在抗病毒、抗肿瘤等领域的应用已有较深入的探讨　　迄今所发现的核酶主要有Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子、RNA酶P的RNA亚基、锤头状核酶（hammerheadribozyme）、发夹状核酶（hairpinribozyme）及丁型肝炎病毒核酶（hepatitisdvirusribozyme,HDVribozyme）等.

2、核酶结构主要分为锤头状结构、发夹状结构和假结样结构（pseudoknotstructure）三类.　　目前用于基因治疗的主要是锤头状核酶和发夹状核酶.与反义寡核苷酸等相比，核酶作为基因治疗新药具有如下优点：1)一个核酶分子可切割多个病毒核酸分子.2)其作用是切断，不是单纯抑制，停药后复发的可能性小.3)与底物通过碱基配对结合，因而有较好的特异性.4)针对多个靶位设计串状排列的核酶，可提高切割效率，减少变异病毒逃逸的机会.5)兼具反义抑制效果〔1〕.人工设计核酶来特异切割病毒RNA，如人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（humanimmun

3、odeficiencyvirustypeⅠ，HIV-Ⅰ）、肝炎病毒等，或切割肿瘤细胞mRNA的实验研究已取得一定成功，有的甚至已开始临床试用.在治疗遗传性疾病及研究发育生物学时，核酶也显示出广阔的应用前景.　核酶抗肝炎病毒的研究　　当前治疗病毒性肝炎的药物包括干扰素在内，效果均不理想.反义寡核苷技术、核酶技术等基因治疗被认为是有希望的抗肝炎病毒措施.目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HepatitisAvirus，HAV）、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）、丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus

4、，HCV）以及HDV作用的研究.目前设计的核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶，大多数研究是在体外无细胞系中进行，但已证实核酶也可在细胞内发挥切割活性〔5〕.　抗HAV核酶　　HAV感染呈急性过程，感染后多能顺利康复并获得持久保护性免疫，甲肝疫苗的预防效果也较好，所以抗HAV核酶的研究不多.针对HAV-RNA第599nt后的位点、两侧底物结合区各长8nt的锤头状核酶A-1，可将123nt长的底物（含HAV-RNA第533-633nt）切割成49nt和74nt两部分.靶位在HAV-RNA第796nt等后的核酶A-2能将长

5、443nt的底物(含HAV-RNA第533-953nt)切割成157nt和286nt两部分.用两种核酶同时切割长433nt的底物，得到49nt、157nt、237nt、286nt、394nt5个片段，故串联排列的核酶可更有效杀伤HAV〔6〕.　　HBVpgRNA中含有一加帽信号ε(encapsidationsingal,ε)，高度保守，对pgRNA的包装和逆转录十分重要.Beck等体外转录出含ε序列的长约170nt的底物，以pgRNA第3136-38ntGUC三体后的磷酸二酯键为靶位，设计4组锤头状核酶，在合适条件下，可切割

6、60%～90%以上底物.进一步将Rz与ε共转染到HuH7细胞上，发现在细胞内Rz活性明显降低；而细胞溶解并用蛋白酶K消化和酚抽提后，又观察到明显的切割效应.此现象产生的确切原因尚不清楚，紫外交联(UV-cross-linking)实验提示细胞内某种蛋白质可与ε结合，妨碍核酶活性的发挥〔。7〕.　　抗肿瘤治疗　　进入20世纪90年代，肿瘤的基因治疗受到广泛的重视.核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA，抑制肿瘤基因的表达，从而达到治疗肿瘤的目的.　　多形性恶性胶质瘤是一种高度血管化的实体瘤.血管内皮生长因子(V

7、EGF)的表达可调控瘤细胞的生长.Ke等针对VEGFmRNA的5′第318nt和165nt作为靶位设计的锤头状核酶能抑制VEGF的表达，从而达到抗癌目的.郑燕芳等针对人乳头瘤病毒(Humapapillomavirus,HPV)16E6基因和18E6基因，设计相应的核酶，体外实验证明能准确、有效地识别和切割靶mRNA，可作为对HPV相关性肿瘤基因治疗的工具.毕锋等设计了抗胃癌c-erbB-2基因的特异性核酶，在脂质体的介导下转染胃癌细胞SGC-7901，并在裸鼠体内观察转染胃癌细胞的致瘤性，结果显示胃癌基因c-erbB-2产物

8、P158的表达率被抑制达62%，生长速度被抑制达55%，表明c-erbB-2特异性核酶对胃癌细胞的恶性表型有明显逆转作用.近年发现端粒酶(telomerase)在恶性肿瘤细胞分裂中起重要作用.Kanzawa〔17〕等将相应核酶分别加入人肝癌细胞株HepG2、Huh-7的细胞提取物中，能抑制