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1、甲泼尼松对兔急性脊髓损伤后MMP-212表达及神经功能影响【摘要】目的探讨兔急性脊髓损伤后应用大剂量甲泼尼松(methylprednisolone)干预基质金属蛋白酶-2、12(MMP-2、12)表达及神经功能的影响。方法家兔随机分为急性脊髓损伤后应用生理盐水对照组(A组)和应用甲泼尼松治疗组(B组),损伤后不同时间点取材,用HE染色观察损伤脊髓组织病理变化;用免疫组化染色检测MMP-2及Real-TimePCR检测MMP-12的表达变化;采用Tarlov评分评价神经功能。结果HE染色镜检发现脊髓组织病理学改变B组明显轻于A组。A、B两组
2、均发现MMP-2、12的表达,MMP-2、12表达A组>B组(P1.5.2实施荧光定量PCR按照试剂盒说明操作,①通过逆转录将样品RNA转变为cDNA;②制备标准曲线样品:进行相对定量,需要将样品的目的基因及管家基因进行PCR扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线;③将标准曲线样品与待测样品分别假入到Real-TimePCR反应液中,进行Real-TimePCR扩增与检测;④检测结果进行标准曲线分析。71.6HE染色病理学观察对假手术组及损伤组在损伤后按时间点进行脊髓取材,取材部位应在打击中央,以4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、
3、石蜡包埋,4μm连续切片,将做好的切片按以下顺序脱蜡:(1)二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min);脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯:无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水;(2)苏木素中浸泡5min,用蒸馏水冲洗,放入盐酸乙醇中浸泡20s,用蒸馏水冲洗,再放入蒸馏水中浸泡15min;(3)伊红染色1min,依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。用中性树脂封片,晾干。1.7改良Tarlov评分法实验动物在术前1h,术后麻醉清醒后6h,损伤后24h,48h、7、14d各组取5
4、只放于开阔空间内观察动物双后肢运动功能。(采用改良Tarlov评分法,标准为:0分:完全瘫痪,针刺下肢无反应。1分:完全瘫痪,针刺下肢有反应,但肢体不能活动。2分:肢体可活动,但不能站立或站立不稳。3分:可站立,但无法行走。4分:可行走数步,但不能稳定。5分:能缓慢行走,但不灵活。6分:正常行走。)1.8统计学方法SPSS12.0软件进行统计分析,血清中MMP-2、12含量及组织PCR荧光定量CT值与细胞阳性表达率采用两样本t检验或t’检验,设α=0.05为检验标准。2结果72.1行为学观察见表1,A、B二两组改良Tarlov评分在伤后24
5、h内三组评分比较无显著性差异(P>0.05),B组同时间点的评分高于A组,B组在损伤后48h运动功能恢复较A组明显改善,A、B两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),伤后7～14d比较两组间差异具有统计学意义(P0.05,表示差异无统计学意义;�#P3讨论1911年Allen提出ASCI后分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段的理论,成为ASCI治疗理念的里程碑,由于原发性损伤的不可逆性因此此后的研究主要针对第二阶段,即继发性损伤的病理生理及其干预手段。7MP是一种合成的糖皮质激素类免疫抑制剂,由于其携带个甲基,它的脂溶性大大提高,穿透血脑
6、屏障和细胞膜的作用大为增强,目前已广泛应用于临床中枢神经损伤急性期,对脑和脊髓损伤起保护作用。美国NASCIS曾经于20世纪80、90年代3次开展该药对ASCI的治疗研究,但3次结果均不一致,因此MP对神经系统的保护作用及其机制没有定论。多数学者认为其主要作用机理在于[1]:①MP具有很强的抑制脂质过氧化作用,中和氧自由基,防止神经细胞的凋亡,促进神经系统的复苏。伤后早期使用MP可抑制这种快速反应;②MP可维持细胞膜及细胞器膜的稳定性,维持细胞内外钙、钠、钾、氯等离子稳态平衡,以减轻神经细胞因离子代谢紊所造成的继发性损害;③MP可维持脊髓组
7、织血流量及改善Na-K-ATP酶的功能,保护神经细胞的有氧代谢,使脊髓水肿得到改善。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一组锌依赖的蛋白水解酶,具有降解多种细胞外基质成分,如胶原、层粘素、明胶、弹性硬蛋白、粘连蛋白及蛋白多糖等功能。因此它对需要基质重建的生理病理过程如生长发育、创伤愈合及修复起到重要作用[2]。现已知MMPs含有不同的底物,除降解细胞外基质外它们还具有多种功能,如调节生理机能、信号发出、血管发生、炎症反应及细胞运动[3,4],所以MMPs的不规则表达对多种疾病的病理过程的发生可起到通
8、讯的作用,包括肿瘤转移、CNS损伤如多发性硬化症,脑卒中,人体免疫缺陷症病毒及创伤等。MMP-2是由Huhtala7P等人在1990年克隆表达的,其结构中含有信号肽、前肽、催化区
