稳定表达野生型pink1蛋白sh

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1、稳定表达野生型PINK1蛋白SH【摘要】目的构建常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征（arep）pink1基因真核表达载体，建立稳定表达pink1蛋白的人神经母细胞瘤（sh-sy5y）细胞株。方法采用聚合酶链反应（pcr）方法，以人胎脑cdna文库为模板扩增pink1基因全长cdna编码区序列，重组dna技术定向插入真核表达质粒pcdna3.1-myc-his(-)b，经酶切和测序鉴定后，用脂质体转染sh-sy5y细胞，通过g418筛选，挑选出稳定转染的单克隆株，经提取gdna进行pcr扩增、反转录-聚合酶链反应（rt-pcr）及rna水平及蛋白水平的表达。结果成功构建了pink1-p

2、cdna3.1-myc-his-(-)b真核表达载体，稳定转染sh-sy5y细胞后，经提取gdna扩增、rt-pcr及entofstableexpressionofentofneurology，xiangyahospitalofcentralsouthuniversity，changsha410008，chinaabstract:objectivetoconstructtheeukaryoticexpressionvectorofautosomalrecessiveearly-onsetparkinsonism(arep)anneuroblastomacellline(sh-sy5y

3、)stably-expressingpink1protein.methodsthefulllengthpink1cdnafragmentplifiedbypcrfromthehumanfetalbraincdnalibraryandeukaryoticexpressionvectorpcdna3.1-myc-his-(-)bono-cloneingofpink1indnalevelrnatranscriptionentbyono-clones.resultspink1-pcdna3.1-myc-his(-)beukaryoticexpressionvectoralrecessivee

4、arly-onsetparkinsonism;pink1;stabletransfection;sh-sy5ycell帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病，大部分呈散发性，致病原因不明，近几年临床和分子遗传学研究发现了呈单基因遗传方式的家族性帕金森病，至少已有7个致病基因被克隆，其中常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征（autosomalrecessiveearly-onsetparkinsonism,arep）有3种基因型（park2、park6和park7），致病基因分别是parkin、dj-1和pink1基因［1-3］。.pink1基因突变是arep的常见原因，仅次于parki

5、n［4-5］，pink1蛋白定位于线粒体上，由581个氨基酸组成，有1个34个氨基酸组成的线粒体定位结域（mitochondrialtargetingmotif,mtm）和1个高度保守的蛋白激酶结构域（156～509位氨基酸），pink1基因的功能目前仍不清楚。本研究旨在建立稳定表达野生型pink1蛋白的sh-sy5y细胞株，为进一步研究pink1基因的功能和arep的发病机制奠定基础。1材料与方法1.1材料脂质体转染试剂盒lipofectaminetm2000和pcdna3.1-myc-his(-)b购自invitrogen公司；pcdna3.1-myc-his(-)b质粒载体购自

6、invitrogen公司；各种内切酶购自neega公司；dmem培养基购自gibco公司；胎牛血清购自paa公司；omem培养基购自invitrogen公司；g418购自amresco公司；sh-sy5y由中国科学院生物物理研究所脑与认知国家重点实验室保存；bca蛋白浓度检测试剂盒购自pierce公司；his标签抗体购自santacruzu公司；羊抗鼠igg购自北京中杉金桥生物技术有限公司；超敏发光液购自pierce公司。1.2方法1.2.1重组真核表达载体的构建根据pink1基因cds序列设计2条外引物（pfhⅰ酶切位点（ggatcc），使得次级聚合酶链反应（pcr）产物克隆入真核

7、表达载体pcdna3.1-myc-his(-)b后，融合载体上的myc-his，并使其读框不变。以ecorⅰ和bamhⅰ双酶切鉴定，采用通用引物进行3个反应的双向测序鉴定。1.2.2sh-sy5y细胞转染转染前1d将sh-sy5y接种于6孔板，待细胞生长至60%～70%融合时进行转染，步骤如下：5μg不同质粒（空载体、野生型）+250μlomem培养基混匀为a液，12μllipofectaminetm2000+250μlomem培养基混匀为b液，室温15m