胃癌组织中mdm2和rb基因表达及临床意义论文

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1、胃癌组织中mdm2和Rb基因表达及临床意义论文【摘要】目的：探讨mdm2,Rb基因表达与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系.方法：采用免疫组织化学技术(SP法)检测18例正常胃黏膜、26例异型增生胃黏膜、18例早期胃癌、38例进展期胃癌患者组织中的MDM2,Rb基因蛋白的表达情况，并与临床病理特征相比较.在此基础上，我们通过RNAi技术特异性降低mdm2的表达水平，观察细胞周期的变化，探讨了mdm2作用的分子机制.结果：MDM2蛋白在正常胃黏膜、I型及II型增生胃黏膜、早期胃癌及进展期胃癌组织中的阳性表达率分别为33.3%

2、，40.0%，43.8%，55.6%.freeldm2后可以明显抑制细胞的增殖.结论：MDM2,Rb的表达可作为判断胃癌生物学行为的一个指标，对预后有一定的指导意义；特异性降低mdm2的表达可以作为胃癌治疗的一个分子靶点.【关键词】胃肿瘤癌前状态mdm2基因Rb基因免疫组化RNA干扰细胞增殖0引言胃癌的发生是一个多阶段、多步骤逐渐演进的过程.这一过程中涉及多种癌基因的激活及抑癌基因的失活.mdm2在多种恶性肿瘤中有基因的突变、扩增及过度表达［1］.但mdm2在胃黏膜早期癌变，特别是与抑癌基因Rb在胃黏膜癌变过程中的协调作

3、用研究较少.因此本研究应用免疫组化法检测从正常胃黏膜、胃黏膜增生、早期胃癌及进展期胃癌这一序列变化中MDM2和Rb基因的表达，探讨两者与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系.在此基础上，我们拟进一步分析mdm2对细胞周期的影响.1材料和方法1．1材料①标本:取自河南科技大学第一附属医院2003/2007年胃切除标本100例.其中正常胃黏膜18例，I型增生10例，II型增生16例，早期胃癌18例，进展期胃癌38例.患者术前均未接受化疗或放疗.所有胃癌病例均经病理证实,并附有完整的临床病理资料.诊断标准参照全国胃癌协作组病理组规定

4、的标准，胃癌组织学类型根据Lauren分型标准，分为两大类，肠型胃癌40例，弥漫性胃癌16例.②试剂:鼠抗人MDM2mAb抗体、Rb鼠抗人mAb抗体和免疫组化染色SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司产品公司.MDM2工作浓度为1∶20，Rb为即用型工作液.针对mdm2靶序列AAGACACTTATACTATGAAAG和不针对任何序列的对照双链RNA干涉序列由上海吉玛基因公司合成.针对mdm2的PCR引物5′CTGTGTTCAGTGGCGATTGG3′，5′AGGGTCTCTTGTTCCGAAGC

5、3′以及GAPDH的引物5′CAATGACCCCTTCATTGACC3′，5′GATCTCGCTCCTGGAAGATG3′交由上海生工生物有限公司合成.SYBRGreen荧光染料购自Takara生物有限公司.胃癌细胞系SGC7901购自上海细胞所.1．2方法1.2.1标本处理所有标本均经40g/L甲醛固定,常规石蜡包埋,连续切片,片厚4μm.载玻片以10g/L多聚赖氨酸(福州迈新生物技术开发公司产品)预处理.1.2.2免疫组化石蜡切片脱腊至水；拟滴加一抗为MDM2基因蛋白的组织切片用pH6.0枸橼酸缓冲液高压热

6、修复10min，拟滴加一抗为Rb基因蛋白的组织切片用pH8.0EDTA缓冲液高压热修复10min；修复后的切片在缓冲液中冷却后,滴加过氧化物酶阻断溶液；用50~100mL/L正常山羊血清封闭，滴加一抗，4℃冰箱孵育过夜；滴加生物素标记的第二抗体，滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液；DAB显色.此外用PBS置换一抗作为空白对照，用试剂盒提供的阳性片作阳性对照.MDM2和Rb蛋白表达阳性细胞着色为细胞核及部分胞质内棕黄色颗粒.在光学显微镜下每张切片随机选择5个区域进行细胞计数，每个区域计数100个肿瘤细胞，阳性细胞比例超过10

7、%为阳性表达，小于10%为阴性表达.SGC7901细胞在含100mL/L血清的1640培养基，50mL/L的CO2的条件下培养.按Lipofectamine2000的说明书操作，将化学合成的siRNA导入7901细胞.转染24h后，收集细胞，提取RNA，反转录成cDNA后进行实时定量PCR检测干涉效果.为研究干涉mdm2后细胞增殖的变化，将转染24h后的细胞按每孔1000个细胞均匀铺至96孔板，分别培养24，48，72h，收集细胞台盼蓝染色后，取样细胞计数台盼蓝染色阳性的细胞数目，统计细胞增殖情况.细胞计数实验每孔重复

8、4次.统计学处理：实验所得的数据采用χ2检验和Spearman等级相关分析，P0.05为有统计学意义.2结果2.1MDM2和Rb在胃癌及癌前病变中的表达MDM2蛋白在正常胃黏膜、I型及II型增生胃黏膜、早期胃癌及进展期胃癌组织中的阳性表达率分别为33.3%（6/18），40.0%（4/10），43.8%（7/16），