结缔组织生长因子对视网膜色素上皮细胞增生和黏附的调节作用

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1、结缔组织生长因子对视网膜色素上皮细胞增生和黏附的调节作用郭长梅，惠延年，王雨生，田艳明，王静波，马吉献【摘要】目的观察重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)对视网膜色素上皮(RPE)细胞增生和黏附的影响。方法用CTGF蛋白、多聚赖氨酸(PLL)和胶原分别包被培养板，观察CTGF促进RPE细胞黏附的作用；用四唑盐(MTT)比色试验和流式细胞仪(FCM)测定RPE细胞增生反应。结果10-30mg/L的CTGF蛋白提高RPE细胞的贴壁黏附能力，与未包被的对照组相比，差异有统计学意义(P0.05)；30mg/LCTGF促进RPE细胞黏附的能力与0.1g/L胶原的

2、作用一致，但略低于0.1g/LPLL的作用。MTT实验显示CTGF刺激RPE细胞生长，CTGF作用24h刺激RPE细胞增生的能力最强。FCM测定细胞周期结果显示S期百分比随着CTGF浓度增加而逐渐增加，无血清培养的对照组S期百分比为(7.5±0.4)%，60μg/LCTGF刺激24h后，S期百分比上升至(16.1±2.0)%。结论CTGF可以促进RPE细胞的黏附和增生，在增生性玻璃体视网膜病变等眼内增生性疾病中可能有重要意义。【关键词】结缔组织生长因子；视网膜色素上皮细胞；细胞黏附；细胞增生增生性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreor

3、etinopathy,PVR)是孔源性视网膜脱离及其视网膜复位手术后的严重并发症，视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelial,RPE)细胞是其主要的增生细胞[1]。RPE细胞在炎性因子等刺激下游离移行，离开原位后附着在玻璃体纤维、视网膜表面和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)上，才能获得异常增生分化的能力。RPE细胞的黏附和异常增生，是PVR病理过程的重要环节,也是目前研究的一个热点。结缔组织生长因子(connectivetissuegrog/L)由中国医学科学院医学生物学研究所病毒免疫室李琦涵教授惠赠；多

4、聚赖氨酸(polyLlysine,PLL)、胶原、小牛血清白蛋白(BSA)、四唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；DNAPrepReagentSystem试剂盒购自美国Coulter公司。　　1.2人RPE细胞培养与鉴定　　从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球，于死亡后24h内分离培养RPE细胞，具体方法参考王雨生等报道的方法[4]。传代细胞用含10%(体积分数)小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基和HamsF12(DMEM/F12)的混合完全培养基(青霉素100u/mL，链霉素100u/mL)，置于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱

5、中培养；用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。取第4-7代细胞用于实验。　　1.3RPE细胞黏附试验　　1.3.1包被培养板　　将纯化的rhCTGF用0.01mol/LPBS配成5、10、20、30mg/L4种不同质量浓度。将4种不同质量浓度rhCTGF、PLL(0.1g/L)、胶原(0.1g/L)分别加入96孔板中，每孔50μL，4℃下孵育16h；10g/LBSA室温下孵育1h，封闭未饱和的蛋白结合位点，无菌PBS冲洗每孔2遍，在超净台中吹干。未包被的培养板作为对照。　　1.3.2黏附试验　　消化收集近铺满期的RPE细胞，用无血清培养液洗涤细胞

6、2次(1000r/min，离心5min)，以2.5×105/mL细胞密度重悬于含10g/LBSA的无血清DMEM/F12培养基中，每孔50μL细胞悬液接种于包被好的96孔板中，置于37℃培养箱中让细胞贴壁。60min后将培养板取出，无菌PBS洗涤每孔2遍以洗去未贴壁细胞。每孔加入含MTT溶液(5g/L，20μL)的新鲜培养液150μL。继续培养4h，弃培养液，每孔加入150μLDMSO，充分振荡10min，在酶联免疫检测仪上在490nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A值)。每个浓度设8个重复孔，试验重复3次。　　1.4CTGF对RPE细胞促

7、增生作用　　1.4.1实验分组　　①无血清对照组；②无血清培养液+rhCTGF组：设4种质量浓度，分别为5、15、30和60μg/L。　　1.4.2MTT比色试验　　2.5g/L胰蛋白酶消化单层培养的RPE细胞，用含10%(体积分数)血清的DMEM/F12培养液制成单个细胞悬液，调整RPE细胞密度为1×104/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL。置于37℃CO2孵箱中培养24h，换用无血清的DMEM/F12培养液使细胞静止24h。按实验分组，再分别加入含不同浓度rhCTGF的新鲜无血清培养液。继续培养12、24、36和48h。在不同培养时间点，每

8、孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃继续孵育4h，中止培养，弃孔内上清液