重组梅毒螺旋体多表位抗原的改进及应用论文

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1、重组梅毒螺旋体多表位抗原的改进及应用论文【摘要】目的对梅毒螺旋体抗原表位进一步优化，以满足梅毒检测试剂的需要。方法用信息生物学软件对梅毒螺旋体TpN47抗原表位进行分析，在我们以前研究工作的基础上，延伸其长度，用化学合成法获得目的基因，插入到pBVIL1载体中，构建pBVIL1/TpN47表达质粒。将新获得的TpN47基因与本研究室保存的TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相连接，进行嵌合表达.freelprovementbasedonrebinantmulti-epitopechimericantigenTreponemapallidumanditsapplicationSONG

2、Xiao-gou，edicalSciences,AMMS,Beijing100850,China【Abstract】ObjectiveInordertodetectKitantibodiesofsyphilis，theepitopechimericantigenofTreponemapallidumizedfurther.MethodsTreponemapallidumTpN47antigenepitopeationbiologysoftent.TherebinantTreponemapallidummulti-epitopechimericantigensulti-epitopechime

3、ricantigense-linkedimmunosorbentassay(ELISA).ResultsImprovementbasedonrebinantmulti-epitopechimericantigenTreponemapallidumantigensulti-epitopechimericantigenofTreponemapallidumemntforneapallidum；multi-epitopechimericantigen;TpN47；panel目前，临床上对梅毒螺旋体感染的检测，常用的方法是血清学检测，如酶联免疫吸附测定（ELISA）［1］法等，此方法所用抗原绝大部分

4、为重组蛋白。在以前的研究［2］中，我们分别选择了TpN15、TpN17、TpN44.5和TpN47的优势抗原表位，进行了克隆和表达，并将此四组基因连接，在E.coli中进行了嵌合表达，此抗原在当时梅毒感染血清学检测中起了重要作用，但随着新一代参考品（panel）的起用，我们发现不能完全满足检测试剂的需要，其原因可能是TpN47基因片段过短所致，因当时为了最大限度缩短基因长度，以降低非特异性反应，仅选用了24个氨基(78～101)。我们再次以梅毒全基因组序列［3］为基础，用Biosun分子生物学软件［4］重新对抗原表位进行了全面系统地分析，增加TpN47基因长度，即选用400个氨基酸（1～40

5、0），这样可能会提高抗原的覆盖面。此片段经与TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相连接，进行嵌合克隆表达纯化后采用双抗原夹心法对梅毒参考品进行测定，其结果符合要求。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株及质粒原核融合表达载体pBVIL1、pBVIL1/TpN15、pBVIL1/TpN17、pBVIL1/TpN44.5表达质粒由本室构建并保存；E.coliHB101，由本室保存。1.1.2工具酶和试剂DNA限制内切酶、PCR产物回收试剂盒、Promega公司生产的T4DNA连接酶及T4DNA聚合酶购自博大泰克生物技术公司；氨苄西林用于配制LB培养基的胰化蛋白胨（bacto-trypto

6、ne）及酵母提取物(bacto-yeast)购自本院条件处。1.1.3引物、序列测定由奥科生物技术有限公司合成，三博远志公司测序。1.1.4梅毒参考品（panel）中国药品生物制品检定所提供。1.2方法1.2.1TpN47抗原表位的选择先从网上Gene-Bank中获得TpN47蛋白的氨基酸全序列，用Biosun分子生物学软件对其抗原表位进行分析，选取抗原性较强部分。1.2.2TpN47基因的合成方法根据所选择的TpN47抗原表位的氨基酸序列，按大肠杆菌的优势密码子，推断出编码抗原表位的基因序列。设计多条有部分重叠序列的基因片段，从中间向两端逐步延伸合成。设计时，如发现基因中有与Xho1、Xb

7、aI1及Spe1相同的酶切位点,要作适当调整。1.2.3PCR扩增、酶切、连接、转化及诱导表达等参照［美］Sambroob,J.等箸，黄培堂等译《分子克隆实验实验指南》第三版有关章节进行。具体扩增条件为95℃1min,55℃1min，72℃1.30min，扩增30个循环后，再72℃延伸7min。1.2.4纯化从表达菌中提取包涵体,.freelMTE、1%β－巯基乙醇,8M脲pH8.5)将其溶解,然后以SP-S