脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析论文

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1、脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析论文.freelyastheniagravis，MG）主要是由乙酰胆碱受体（acetylcholinereceptor，AchR）抗体介导的，补体参与，细胞免疫依赖性，针对神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病。对于MG的治疗至今仍缺乏有效手段。蛋白质组技术利用其核心技术双向电泳（ten-sionalgelelectrophoresis，2-DE）对组织或细胞总蛋白质进行分离［1］，并通过正常与疾病组织的差异表达蛋白比较，找到与该疾病相关的蛋白质分子。本研究通过建立脾肾虚型重症肌无

2、力患者和正常人血清总蛋白质的双向电泳图谱，寻找有明显差异性表达的蛋白，对差异表达的蛋白进行鉴定和研究，为进一步研究MG发病机制以及MG诊断治疗提供实验基础。1材料与方法1.1血清采集MG患者全血来自2004～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70℃冰箱冷冻保存备用。1.2主要试剂固相pH梯度干胶条IPGstrip（Amersham

3、公司产品，非线性pH3～10，7cm）。3-［3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸盐｛3-［（3-cholamidopropyl）dimethylamino］-1-propanesul-fonate，CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），三丁基膦（tributylphosphine，TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N，N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetram-ethyl

4、-ethylenediamine，TEMED），过硫酰胺（am-moniumpersulfate，APS），三羟甲基氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane］、甘氨酸（glycine，Gly）和十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS）均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。1.3主要仪器高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorⅡ，AmershamBiosci-ences公司产品

5、;P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-DaltonicsAutoFlexTOF-TOFLIFTMassSpectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQDecaXPPlus，美国ThermoFinnigan公司产品。1.4双向电泳1.4.1血清总蛋白质的提取及定量血清-70℃反复冻融4次后，用AgilentMul

6、tipleAffinityRe-movalColumn处理去除高丰度蛋白。使用Agilent5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70℃保存。用裂解液（9mol/L尿素、4%CHAPS、65mmol/LDTT和cocktail酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。1.4.2等电聚焦自-20℃取出的胶条，室温下平衡10min，以500μg上样量在每份样本中加入上样缓冲液（8mol/L尿素、2%CHAPS、1%Bio-lyte和1%TBP）以及标准蛋白质分子，上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下:30V12h，500V1

7、h，1000V1h，8000V6h。恒温20℃。等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1（Tris-base50mol/L、尿素6mol/L、甘油30%、SDS2%、溴酚蓝0.002%和DTT100mg）中于振荡器上振荡15min;然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用400mg碘乙酰胺代替100mgDTT）同样于振荡器上振荡15min。1.4.3SDS-PAGE垂直电泳采用12.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶（水23.2ml，30%丙烯酰胺溶液32.46ml，1.5mol/LTris-HCl缓冲液pH8.820ml，10%SDS0.8ml，10%A

8、PS0.4ml，TEMED3.76μl，胶总体积80ml）。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。