磷氮霉素生物基因簇中的调控基因之功能研究及几个结构基因的改造

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1、磷氮霉素生物基因簇中的调控基因之功能研究及几个结构基因的改造1前言1.1组合生物合成简介近来，天然产物的多样些年性，使得这类化合物成为新药的重要。据统计，超过40%的现代临床药物直接或间接地于天然产物，而目前临床应用的抗感染药物中有70％以上直接或间接地于微生物源天然产物，在抗肿瘤药物中源于天然产物的药物也超过50％的比例[1-3]，组合生物合成是通过对微生物代谢产物途径中的遗传研究，控制生物合成新型的复杂的化合物。这是以了解生物合成途径以及克隆有关生物合成基因为基础的生物技术，在体外对不同（种内或种外）的基因进行删除、取代、重组，然后导入到宿主菌中合成一系列

2、化合物[4]（图1-1），它与组合化学不同，它是在基因水平上由微生物自身合成化合物，是一种利用天然产物生物合成机制获得大量新的―非天然‖天然产物的方法。在众多组合生物合成的途径中，聚酮类生物合成途径的研究最多，应用最为广泛。通过基因水平改变其生物合成途径，进而产生新的聚酮类化合物，用于开发新药。Ⅰ型PKS是由几个多功能的多肽组成的，每一个多肽上都携带有参与聚酮生物合成所必需的各种酶的结构域，每个结构域只能参与整个聚酮碳链构建中的一步生化反应[8]，编码合成酶单位的DNA区域称为一个模块（module）。Ⅰ型PKS主要催化合成大环内酯类、聚烯及聚醚类化合物。红霉

3、素PKS基因簇也代表了典型的模块式PKS（图1-2），编码几个大的多肽链,从氨基端到羧基端分为装载(loading)功能域、多个模块区、释放功能域。起始功能域由酰基转移酶(acyltansferase,AT(L))和酰基载体蛋白(acylcarrierprotein,ACP)等功能域组成;1989年Bibb、Sherman等人分析了粒菌素(granaticin),放线紫红素(actinorhodin)[9][10]PKS基因发现了II型酶的结构。研究发现，Ⅱ型PKS是一个多功能酶复合体，只包含一套可重复使用的结构域，每一结构域在重复的反应步骤中都多次地用来催化

4、相同的反应[11]，Ⅱ型PKS与Ⅰ型PKS相比，结构的多样性较少，主要催化芳香族聚酮化合物的生物合成。如图1-3，丁省霉素的Ⅱ型PKS合成途径。Ⅲ型PKS属于查尔酮（chalcone）合成酶类，是一种可重复使用的同源双亚基蛋白，主要负责单环或双环芳香类聚酮化合物的生物合成。聚酮链的构成单位与催化它形成的PKS模块是一一对应的。尽管结构和机制不相同，所有类型的PKS都是通过酰基-CoA脱羧缩合和KS的结构域或亚基催化C-C键的形成[12]。目前，合成生物学正逐渐被科学家所认同，它的关键是在基因和蛋白功能水平上认识和理解复杂天然产物的生物合成机制，以化学和生物理论

5、为基础，合理设计重新构建能够在微生物中实现的生物合成途径，进而实现目标化合物的高效生物合成。近年来，国际上针对天然产物的合成生物学研究有了很大进展，许多催化复杂的化学反应的生物催化体系或基因原件被发现或构建成功[13]。本课题研究所涉及的磷氮霉素类化合物属于一类线性聚酮类化合物，针对此课题所开展的内容就是以合成生物学为理论，克隆得到磷氮霉素的生物合成基因簇，运用基因水平的研究方法，研究磷氮霉素生物合成基因簇中基因的功能，为开发磷氮霉素在生产实践中的应用提供了一定的理论基础。1.2.磷氮霉素简介及国内外研究现状1.2.1磷氮霉素的简介本课题所研究的磷氮霉素（PL

6、Ms）属于聚酮类化合物。首次发现是在20世纪80年代由我国的沈寅初院士等人[14]在日本福岛市土壤中分离得到的菌株StreptomycesRK-803发酵产生的一系列活性物质，随后发现多种链霉菌产生类似的化合物。这种化合物对多种植物病原菌有很好的抗真菌活性。后进一步的分离及结构鉴定发现，磷氮霉素类化合物具有磷酸基团、氨基基团、六元环等的共同结构。研究者因这些化合物R基团的差异，将它们分为若干组分[15]，如图1-4所示磷氮霉素的化学结构式。这一系列的化合物的平面结构包含共轭二烯、环己烷、磷酸酯等官能团[16]。此类化合物可溶于甲醇、乙醇和碱性水溶液中，微溶于中

7、性及酸性水溶液[17]。因为其特殊的磷酸、氨基基团和六元环的结构，这类分子的生物活性也比较广泛。上世纪报道了磷氮霉素这类化合物具有很好的抗真菌的活性，特别是抗植物真菌活性[18]。此外，磷氮霉素类化合物还具有一定的抗肿瘤活性[19]，研究表明磷氮霉素组分对人类的磷酸酶2A（PP2A）有一定的抑制活性[20]，该类化合物通过磷酸基团结合到目标靶点上，发挥一定的抑制作用[21][22]。但是磷氮霉素类化合物在应用方面有很多局限性因素，比如由于R基团不同而导致的多组分不确定性，以及其天然条件下不稳定性等，另外重要的一点是磷氮霉素类化合物具有一定的哺乳细胞毒性[23]

8、。虽然种种不利的因素限制了这类化合物的