sansanmycin生物基因簇之克隆及生物调节基因ssaa管控体制研究

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1、Sansanmycin生物基因簇之克隆及生物调节基因ssaA管控体制研究前言目前，pacidamycin(7,8)和napsamycin(9)的生物合成基因簇己经被成功克隆，生物信息学分析表明这两个基因簇之间具有很高的序列相似性，它们均含有负责肽链合成的非核糖体肽合成酶（non-ribosomalpeptidesynthetase,NRPS)基因、DABA合成基因、尿苷修饰基因、抗生素转运基因及后修饰基因等。基于生物信息学分析及体内外的生物学实验结果，pacidamycin的生物合成途径已经得到比较详细的解释(7,10)。一般来说，

2、抗生素的生物合成基因簇中往往至少存在一个转录调节基因，控制该抗生素的生物合成。然而，Zhang等通过BLASTP分析在pacidamycin生物合成基因簇中并没有发现转录调节基因(7);在Kaysser等报道的napsamycin生物合成基因簇中，npsA编码的蛋白与Streptomyceshygroscopicus中可能的ArsR家族转录抑制子Mpps蛋白具有42%的相似性，从而推测npsA可能为napsamycins的生物合成调节基因(9)，但目前尚无利用生物学实验对NpsA的功能进行验证的报道。链霉菌能产生大量具有药用价值的次

3、级代谢产物，包括临床用抗生素、抗癌药物及免疫抑制剂等。多数抗生素的生物合成存在精细的调控机制，通常涉及三个水平：全局性调控，多效性调控和途径特异性调控(11,12)。途径特异性转录调控基因位于抗生素基因簇内，通过控制生物合成基因的转录水平来控制着相应的抗生素的生成，这种调控方式往往处于多水平调控网络的最下游。大部分的途径特异性转录调控因子是属于链霉菌抗生素调控蛋白家族Streptomycesantibioticregulatoryprotein,SARP)，此类蛋白N-端含有一个DNA结合结构域（DNAbindingdomain,D

4、BD)，C-端含有一个细菌转录激活结构域(bacterialtranscriptionalactivationdomain,BTAD)(13),如控制放线紫红素生成的ActII-0RF4。链霉菌LAL(largeATP-bindingmembersoftheLuxRfamily，LAL)家族转录因子也常存在于一些抗生素的基因簇内，如pikromycin基因簇中的PikD(14)。此外，其他类型的转录调控因子最近也被陆续报道，如多炼大环内酯类抗生素pimaricin生物合成的转录激活子PimM是由N-端的PAS感应结构域和C-端的DN

5、A结合结构域构成的(15);非典型的反应调节因子（atypicalresponseregulators,ARRs)的N-端是一个REC结构域（receiverdomain),C-端是一个DNA结合结构J：或(16)。抗生素调控因子的多样性，提示其调控机制的多样性。研宄表明，jadomycin的途径特异性转录激活因子JadR(ARRs家族成员），其DNA结合活性受到终产物jadomycins的负反馈调控，从而实现对jadomycin生物合成的精细调控(17)。十一烧基灵菌红素的途径特异性转录激活因子RedZ(17)，auricin的途

6、径特异性转录激活因子AurlP(18)也存在类似的调控模式。以上研究报道表明，对于ARRs来说，其活性受到途径特异性产物的反馈调控也许是一种普遍存在的现象。然而其他类型的转录调控因子是否也采取类似的调控机制还需要进一步的研究。本工作首先对sansanmycin生物合成基因簇进行克隆，通过蛋白质三级结构比对，预测生物合成基因簇中.基因编码产物为一种新型的调控蛋白，N端含有FHA(forkhead-associated)结构域，C端含有LuxR类HTH(helix-tum-helix)模体，通过对基因进行体内外功能的研究，阐明了的正调控

7、功能，并发现终产物sansanmycin对SsaA存在负反馈调控作用。实验材料1.菌株和质粒Streptomycessp.SSCGMCC1764Sansanmycin产生菌（野生型）1SS/AKO基因敲除后的突变株本工作构建SS/AKO/pL-ssaASS/AKO中导入过表达质粒pL-ssaA，Am'本工作构建SS/pL-ssaAssaA基因过表达菌株，Amf本工作构建EscherichiacoliDH5a通用大肠杆菌克隆宿主19E.coliET12567/pUZ8002用于在大肠杆菌及链霉菌之间进行接合转移的宿主20E.c

8、oliXLl-BlueMR构建基因组文库宿主菌StratageneE.coliBSA和SPR实验表明，终产物sans_ycins对SsaA的DNA结合活性具有负反馈调控作用。