妥布霉素的生物合成基因簇中627脱氢酶基因的研究

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1、关于学位论文独立完成和内容创新的声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：仑永缸签字日期：≥。锣年‘月毕日学位论文版权使用授权书论文《妥布霉素生物合成基因簇中6’一脱氢酶基因的研究》系生金型堂皇生物剑药学院邀生塑皇生丝药堂专业金丞红在沈阳药科大学

2、攻读博士口顾士团学位而完成的作品。本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权沈阳药科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在El-__--年／口五L年解密后适用本授权书。2、不保密团。(请在以上相应方框内打“4”)作者签名：食朱缸导师签名：玉裤f日期：沁星年‘月诈日日期：炒萝年6月呷日沈阳药科大学硕士学位

3、论文目录摘要黑暗链霉菌H6(StreptomycestenebrariusH6)产生三种抗生素：安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B。为研究妥布霉素生物合成基因簇中tacB基因的功能，利用PCR扩增获得tacB及其上下游部分序列，Sail酶切剔除了基因内部部分序列，构建基因阻断载体pHZl32-AtacB，经接合转移导入黑暗链霉菌H6中。首先筛选到红霉素抗性的单交换菌株，无药传代后，点种筛选到红霉素敏感的菌株，进一步利用PCR、测序筛选到双交换的tacB基因阻断株＆tenebrariustacB一。

4、经发酵产物分析，阻断变株合成一种新的抗生素组分。通过离子交换的方法，提取阻断株所产生的新组分，MS、NMR分析确定该新组分为3’．脱氧．氨甲酰卡那霉素C。为排除基因阻断导致的极性效应，对阻断株进行互补实验。完整的tacB基因由汞抗性基因启动子(PmerR)启动，构建基因互补质粒pSETl52一tacB，经接合转移转化阻断株＆tenebrariustacB一，筛选获得红霉素抗性转化子，发酵产物分析获得互补菌株＆tenebrariustacB一一tacB。进一步产物提取，HPLC．ELSD分析确定互补菌株恢复产生

5、了氨甲酰妥布霉素。氨甲酰妥布霉素与3’一脱氧．氨甲酰卡那霉素C在结构上仅有的差别：前者为6’一氨基，而后者为6’．羟基。Blast分析推测TacB为脱氢酶，本实验最终证明了TacB为6’．脱氢酶，为阐明完整的妥布霉素生物合成途径奠定基础。关键词：黑暗链霉菌；3’一脱氧．氨甲酰卡那霉素C；6’．脱氢酶；基因阻断与互补沈阳药科大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTStreptomycestenebrariusH6producesthreekindsofantibiotics：ampramycin，carbamo

6、yltobramycinandsomecarbamoylkanamycinB．TostudythegenefunctionoftacBfromthebiosyntheticgeneclusteroftobramycin，afragmentincludingtheintacttacBwasamplified，andthentheSa／l-Sa／IfragmentinternaltotacBwasreleasedandself-ligated．ThedismptionvectorpHZl32-AtacBwasco

7、nstructedandtransferredintoStreptomycestenebrariusH6byconjugation．Single-crossoverexconjugantswereobtainedusingerythromycinasaselectivemarker，andthenerythromycin—sensitivestrainswereselectedaftersporulmionintheabsenceoferythromycin．Thedouble-crossoverdisrup

8、tionmutantnamed＆tenebrariustacB—WasconfirmedbyPCRandsequencing．andanewcomponentinthefermentationbrothofS．tenebranustacB—Wasdetectedbyfurtheranalysis．ThenewantibioticproducedbythedisruptionstrainWasisol