血管内皮生长因子反义寡核苷酸联合低分子肝素治疗小鼠膀胱癌论文

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1、血管内皮生长因子反义寡核苷酸联合低分子肝素治疗小鼠膀胱癌论文范海涛，王秀岩，柴红梅，刘禄成【摘要】目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸和低分子肝素法安明单用或联合对小鼠膀胱癌、转移的抑制作用。方法制备小鼠膀胱癌模型40只，随机分为对照组、VEGF反义寡核苷酸（ASODN）组、VEGF错义寡核苷酸（MSODN组）、低分子肝素（LMSODN、法安明及VEGFASODN+法安明皮下注射，隔日1次.freel(fragmin)ontumorgroetastasisofmicebladdercancer.MethodsFortymiceizedlydi

2、videdintofivegroups:controlgroup,VEGFantisenseoligonucleotides(ASODN)group,VEGFmismatchsenseoligonucleotides(MSODN)group,loolecularchloride,VEGFASODN,VEGFMSODN,fragmin,andVEGFASODNplusfragminesaltogether).Thevolumeandorseasured,andtherateofpelviclymphonodemetastasisicrovesselde

3、nsity(MVD)intumormasseasuredbyimmunohistochemistrystaining.VEGFproteinlevelintumortissueent,thetumorgrophonodemetastasisinmaydoincanenhanceantiumoreffectofVEGFASODN.Keyolecularolecularatchsenseoligonucleotide，MSODN）6，现将VEGFASODN和低分子肝素法安明单用或联用治疗荷膀胱癌小鼠，探讨两者对肿瘤生长和转移的抑制作用及其相关机制。1材料

4、与方法1.1主要试剂法安明（Fragmin，dalteparinsodiuminjection）由辉瑞制药有限公司惠赠；Ⅷ因子相关抗原（FactorⅧrelatedantigen）一抗，PV9000试剂盒，VEGF鼠多克隆抗体IgG，美国Zymed公司产品。1.2荷膀胱癌小鼠模型的建立人膀胱移行细胞癌系T24购自中科院上海分院细胞所；雌性C57BL近交系小鼠，6周龄，体重（20±2）g，二级清洁动物，由吉林大学实验动物中心提供。参见文献7。用游标卡尺测量肿瘤大小，按公式体积=π/6×长×宽×高，计算肿瘤体积。取每组平均数。1.3实验动物分组C57BL小鼠

5、40只，随机分成5组，每组8只，接种后16h分组给药：（１）对照组：生理盐水100μl/次，环瘤皮下注射；（２）ASODN组：VEGFASODN100μl/次（33μg/次），环瘤皮下注射；（３）MSODN组：VEGFMSODN100μl/次（33μg/次），环瘤皮下注射；（４）LMVD）的免疫组织化学检测采用三步法，以生理盐水代替一抗做阴性对照，MVD计数按文献8的方法，微血管的计数标准：Ⅷ因子相关抗原阳性的单个细胞、一个细胞簇、血管干上的分支结构，以上情况均作为一支血管。1.6SF，1μg/lAprotinin），以2000r/min匀浆30s×2

6、后，于4℃，10000g离心30min，收集上清，Bradford方法蛋白定量。取100μg总蛋白和适量标准蛋白分子量混合物，加入缓冲液，调整体积在40μl，100℃变性3min后，用SDSPAGE凝胶蛋白电泳分离蛋白，再将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素滤膜转到丽春红液染色2min。蛋白带出现后，于室温用去离子水冲洗硝酸纤维素滤膜5min，软铅笔标记出标准蛋白分子量的位置。把硝酸纤维素滤膜放入面积大小相近的塑料盒中，用5%脱脂奶封闭后，按滤膜面积大小加入VEGF鼠多克隆抗体IgG，置摇床平台于室温孵育4h，用TBS洗涤3次，每次30min。按滤

7、膜面积加入含辣根过氧化物酶标记的二抗，室温平缓摇动敷育1～2h，用TBS洗涤3次，每次30min。DAB显色。实验重复3次，用HP3770扫描仪扫描得到显色的蛋白带图像。1.7数据统计与分析所有统计分析均采用SPSS10.0统计软件完成。各治疗组不同时间肿瘤体积大小比较采用重复测量方差分析；各治疗组瘤重、微血管密度比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。2结果2.1对肿瘤生长的抑制作用小鼠对治疗的耐受性较好，各组小鼠未见出血及其他的药物副作用，实验结束前无小鼠死亡。治疗后ASODN组、LMSODN组小鼠成瘤率早，瘤体进行性增大；ASODN组和联合治

8、疗组成瘤时间较晚，肿瘤生长明显受抑制（P0.01）。各治疗组瘤重及