脂多糖对大鼠下丘脑室旁核gababr1阳性神经元的激活作用

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1、脂多糖对大鼠下丘脑室旁核GABABR1阳性神经元的激活作用【关键词】脂多糖类基因Fosγ氨基丁酸B受体亚单位1(GABABR1)荧光抗体技术下丘脑室旁核(PVN)应激0引言脂多糖(LPS)进入机体能够诱导免疫细胞分泌炎性细胞因子，激发机体的免疫应激反应，动物注射LPS是研究免疫系统和神经系统之间关系的常用模型［1］.γ氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统重要的抑制性神经递质，通过离子型受体GABAAR和代谢型受体GABABR发挥作用［2-3］.GABABR包括GABABR1和GABABR2两个亚型，其中GAB

2、ABR1是受体的主要部分［2］.下丘脑是人体神经内分泌及自主神经系统的整合中枢，室旁核（PVN）是下丘脑内的重要核团，它通过下丘脑垂体肾上腺轴等途径参与各种应激反应的调节［4］.以往的研究［5-6］表明，在下丘脑PVN内有表达GABABR1的神经元.另一方面，LPS刺激可引起PVN神经元表达Fos［7-8］，说明PVN神经元参与由LPS激发的免疫应激反应的调节,但LPS是否激活PVN内GABABR1阳性神经元尚缺乏直接的证据，我们对此进行研究以阐明GABA及其受体在下丘脑对免疫应激反应的影响.1材料和方法1

3、.1材料健康成年SD雄性大鼠12只,体质量200～250g，由第四军医大学实验动物中心提供.兔抗Fos抗体(Sigma公司)；豚鼠抗GABABR1抗体,得克萨斯红结合的羊抗兔IgG,异硫氰酸荧光素（FITC）结合的驴抗豚鼠IgG(Chemicon公司)；Leica1800恒冷箱切片机（德国莱卡公司）；FV1000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）.1.2方法1.2.1动物模型的建立及切片制备动物购入后置于安静、温暖(25℃左右)、避强光和自由摄食的环境中饲养48h，避免非特异性应激反应的发生.将动物随机

4、分为实验组（6只）和对照组（6只）.于8∶00点在大鼠清醒状态下,对实验组大鼠迅速腹腔注射300μL生理盐水溶解的LPS，250g/kg；对照组注射等剂量的生理盐水.两组动物在上述相同环境中放置3h后，用过量10g/L戊巴比妥钠(>40mg/kg)深度麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以100mL生理盐水洗去血液，继用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/LPBS（pH7.4，4℃)先快后慢灌流固定，取出全脑置于相同的灌注液中后固定4～6h，然后将材料移至含300g/L蔗糖的PB内，4℃保存直至组织沉

5、底.恒冷箱切片机切制含PVN［9］的间脑连续冠状切片，片厚30m，切片共分5套，分别用于Fos，GABABR1单标记和双标记以及对照，另一套做备用.切片收集于盛有0.01mol/LPBS的网格内，PBS洗3次×10min，待用.1.2.2免疫荧光双标记染色将兔抗Fos抗体(1∶500)和豚鼠抗GABABR1抗体(1∶1000)用含10g/L小牛血清白蛋白和1g/LTritonX100的0.01mol/LPBS混合后常温孵育切片24h，用0.01mol/LPBS洗3次×10min,然后用得克萨斯红交联的羊抗兔I

6、gG(1∶500)和FITC交联的驴抗豚鼠IgG(1∶500)混合液常温孵育切片2h，用0.01mol/LPBS洗3次×10min,将组织切片贴于载玻片上,自然凉干,用含500g/L甘油的0.01mol/LPBS封片.单标记过程同上，抗体用相应的组套.在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像.1.2.3对照实验除一抗用正常的血清白蛋白代替外，其他程序与上述过程相同，正常血清孵育的组织片上检测不到Fos和GABABR1免疫阳性神经元.统计学处理：每只大鼠在含PVN前、中、后平面上各选取3张切片，计数单标记和双标记的神经

7、元数量,取每组6只的平均值.结果以x±s表示,用SPSS13.0对组间差别进行t检验，P<0.05表示有统计意义.2结果2.1GABABR1在下丘脑室旁核的标记GABABR1阳性产物见于神经元胞膜和胞质内，标记的神经元发出明亮的绿色荧光，细胞轮廓清楚，胞核未染，细胞形态多呈圆形，突起不明显（图1A,B）.阳性神经元较多地分布在下丘脑PVN外侧大细胞部，并向内延续到小细胞部及腹侧部，但数量逐渐减少、染色强度逐渐减弱.虽然LPS组的GABABR1阳性神经元数较对照组稍多、有些神经元染色较重，但两组之间的差异无

8、统计学意义（图2）.2.2Fos在下丘脑室旁核的标记Fos阳性神经元发出明亮的红色荧光，阳性产物限于胞核内，胞核深染、圆形，边缘光滑，胞质未染色，因而树突、胞体未显示.对照组大鼠Fos仅有零星散在分布（图1C）.LPS组Fos阳性神经元主要见于下丘脑PVN内侧小细胞部和腹侧部，在外侧大细胞部也有少量分布（图1D）；LPS实验组的Fos阳性神经元数量显著增多，常是对照组的数倍，两组比较差