hterc基因在宫颈上皮癌变过程中的表达及诊断意义

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1、hTERC基因在宫颈上皮癌变过程中的表达及诊断意义　　液基细胞学检查的广泛应用明显降低了宫颈癌的发病率，但其筛查敏感度较低，易出现假阴性结果［1］。HPV感染是宫颈癌发病的首要因素，HPVDNA检测也成为宫颈癌筛查的一种重要手段，但由于大多数HPV感染具有自限性，很少进展成高级别病变，因此HPV检测在宫颈癌筛查中特异度也偏低，易出现假阳性结果［2］。且上述筛查手段(包括联合筛查)仅把可能的宫颈病变找出来，对早期病变的进展及转归无法准确判断，故筛查结果并不是十分可靠的恶变潜能指标。因此，临床上迫切需要一种新的方法和指标以早期发现尚处于低度病变的高危患者。近年来研究发现，人端粒酶ＲNA基

2、因(humantelomeraseＲNAponentgene，hTEＲC)的异常表达是肿瘤发生的基础，hTEＲC基因的异常扩增也可能是宫颈癌形成的早期事件［3，4］。本文通过FISH技术分析了hTEＲC基因在宫颈上皮癌变过程中的表达，评估hTEＲC基因检测的临床价值，为宫颈CIN的早发现、早诊断提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1材料收集并筛选2011-052013-05间在本院专科就诊的115例宫颈活检组织标本，参照《病理学》诊断标准［5］，分为正常组(包括炎症者)25例，CINⅠ27例，CINⅡ26例，CINⅢ18例，宫颈癌(鳞癌)19例;患者年龄18～64岁，平均37.3岁

3、。所有标本均由2名高年资病理医师统一确定诊断。FISH所用GSPTEＲC/CSP3探针由广州安必平医药科技有限公司提供。　　1.2方法　　1.2.1组织制片所有活检标本经4%中性甲醛固定6～24h，全自动组织脱水机处理，常规石蜡包埋，4μm厚切片，65℃下烤片过夜备用。　　1.2.2检测前预处理65℃烤片5min，室温下二甲苯20min2;100%乙醇5min1;依次100%、85%、70%乙醇各1次3min，去离子水3min。100℃的沸水20min，晾干。37℃蛋白酶K工作液消化8～20min，镜下观察，消化适宜后，2SSC溶液中漂洗5min2。依次70%、85%、100%

4、乙醇脱水，各3min，室温晾干。　　1.2.3FISH检测①避光滴加10μl杂交液(含探针)，荧光原位杂交仪上变性及过夜杂交(变性温度83±1℃，5min;杂交温度42℃)。②次日移去盖玻片，放入46±1℃的2SSC溶液5min2。70%乙醇3min，暗处自然干燥。滴加10μlDAPI复染剂，暗处－20℃放置20min后，荧光显微镜下观察。　　1.3结果判定①信号判定:GSPTEＲC探针的荧光信号为红色，CSP3对照探针信号为绿色。正常细胞间期胞核中红、绿信号各2个，若单个胞核中红色信号＞2个，绿色信号≥2个，则该细胞为TEＲC基因扩增异

5、常细胞。②阈值建立:参照文献［6］报道，取20例正常宫颈标本，以上述方法行FISH实验，每例分析100个细胞，统计出现TEＲC基因扩增异常细胞数目的百分比。异常阈值=平均数+3标准差。本研究TEＲC阈值=7.13%，故设≥8%为异常阈值，判断TEＲC基因扩增结果阳性。③结果判读:每例样本随机计数100个细胞，若异常细胞数的百分比＞阈值，为(+);若＜阈值，为(－);若等于阈值，则加大观测细胞数。　　1.4统计学分析采用SPSS13.0统计学软件分别进行χ2检验、Fisher确切概率法、Spearman等级相关分析及方差分析，绘制ＲOC曲线，计算ＲOC曲线下面积;以病理为

6、最终诊断计算hTEＲC基因检测对识别高级别宫颈病变(≥CINⅡ)的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值和诊断比值比。　　2结果　　2.1hTEＲC扩增率115例宫颈活检组织标本中，hTEＲC基因在正常组、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞状细胞癌组中的扩增率分别为4%、22.2%、73.1%、83.3%和94.8%，hTEＲC基因的扩增率随着病变程度的加重而增高，各组间差异显着(P＜0.01)，尤其当宫颈病变由低级别(≤CINⅠ)转变为高级别甚或癌时(≥CINⅡ)，hTEＲC基因的扩增率显着升高(χ2=13.75，P＜0.01)。同时，hTEＲC

7、基因的扩增率与病变的恶性程度呈正相关(r=0.696，P＜0.01)(表1)。　　2.2hTEＲC基因阳性扩增的异常细胞数hTEＲC基因扩增的异常细胞数在宫颈低级别病变(正常和CINⅠ)时就可出现，但均处于较低水平，差异不显着(P＞0.05);而当病变由低级别转变为高级别(≥CINⅡ)时，异常细胞数则显着提高(F=25.42，P＜0.01)，且稳定在较高水平(CINⅡ～癌组间无差异，P＞0.05)。hTEＲC基因扩增的异常细胞数与宫颈病变的恶性程度呈