亚叶酸钙细菌内毒素检查方法的建立

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1、亚叶酸钙细菌内毒素检查方法的建立【摘要】目的建立亚叶酸钙细菌内毒素检查方法。方法参照《中国药典》2005年版二部收载的细菌内毒素凝胶法对亚叶酸钙进行实验。结果通过干扰试验证明将亚叶酸钙稀释成0.5mg·ml-1后对试验无干扰作用,用灵敏度为0.25EU·ml-1的鲎试剂检查细菌内毒素方法可行，有效。结论浓度低于0.5mg·ml-1的亚叶酸钙其菌内毒素检查法可以代替家兔法来控制亚叶酸钙注射液的质量【关键词】亚叶酸钙干扰试验细菌内毒素热源检查前言亚叶酸钙是一种抗癌药，临床上主要用于治疗晚期结肠、直肠癌[1]。细菌内毒素检查法有快

2、速、准确、灵敏、经济实用等优点，但2005版中国药典正文规定的热原检查项中，执行家兔检查法。所以本文对亚叶酸钙的热原检查采用细菌内毒素法进行试验，评价亚叶酸钙采用细菌内毒素法的可行性。1﹑实验材料和仪器1.1实验材料细菌内毒素检查用水：批号：090507，规格：5ml/支湛姜博康海洋生物有限公司。鲎试剂：批号：0802020，灵敏度：0.25EU/ml；批号：0801080，灵敏度：0.125EU/ml批号：0802030，灵敏度：0.05EU/ml；批号：0708280，灵敏度：0.06EU/ml；批号：0903252灵敏

3、度：0.03EU/ml湛江博康海洋生物有限公司；批号：0806020，灵敏度：0.25EU/ml湛江安度斯生物有限公司。受试品（S）：亚叶酸钙注射液：批号：20090902、20090702、20090502，规格：100ml亚叶酸钙0.1：氯化钠0.9，大连天宇制药有限公司。细菌内毒素国家标准品：批号：981，效价：9000EU/支湛江安度斯生物有限公司。1.2实验仪器H根据热原检查法[1]亚叶酸钙注射液，剂量为10ml/kg，可得L＝0.5EU/ml。2.1.2受试品最小有效稀释浓度CMVD的范围2005年版中国药典规定

4、最小有效稀释浓度由下面公式确定：C＝λ/L市售的鲎试剂灵敏度一般在0.03～0.5EU/ml，对于灵敏度为0.03、0.06、0.125、0.25、0.5EU/ml的鲎试剂，CMVD浓度分别为0.06、0.12、0.25、0.5、1.0mg/ml；2.2鲎试剂灵敏度复核[2]鲎试剂灵敏度的复核试验应按照中国药典2005年版方法规定的条件下进行,鲎试剂的灵敏度用λ表示。将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水（BET）溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的细菌内毒素标准溶液，每稀释

5、一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的试管18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水（BET）作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃恒温器中，保温60分钟。结果见表1表1两种鲎试剂复核试验结果内毒素浓度EU/ml0.50.250.120.06NC反应终点浓度重1++———0.25复2++———0.25管3++———0.25数4++———0.25注：NC为阴性对照管λ=lg-1（∑Xx/4）=lg-

6、1（lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25）=0.25EU/ml结果表明：鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml在0.5λ～2.0λ的范围内，符合规定。2.3干扰预试验方法：将受试品用细菌内毒素检查注射用水BET稀释成4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml的供试品溶液分别使用λ＝0.5EU/ml、λ＝0.25EU/ml、λ＝0.125EU/ml的鲎试剂进行预干扰试验，结果见表2。表2不同浓度受试品干扰预试验结果TALEU/ml浓度mg/ml4210.50.25NCPCλ＝0.

7、5NPC------------++PPC1--++++++++PPC2----------λ＝0.25NPC----------PPC1----++++++PPC2----------λ＝0.125NPC----------PPC1------++++PPC2----------注：NPC为样品溶液；PPC1为样品溶液中含有2λ内毒素；PPC2为样品溶液中含有1/4λ内毒素;NC为阴性对照管；PC为阳性对照管。结果表明：亚叶酸钙注射液浓度在0.5mg/ml以下时，对鲎试剂的凝集反应无增强或抑制作用。2.4干扰试验[3－4]

8、根据干扰试验的结果可知受试品溶液的最大不干扰浓度为0.5mg/ml，在最小有效稀释浓度范围内，使用两个厂家的鲎试剂（λ=0.25EU/ml）进行反应，每一浓度做4管同时用上述稀释液和内毒素检查用水（BET）各做2支阴性对照管，按Es=Log－1(∑Xs/4)和Et=Log－1(∑Xt/4)