细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题

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1、细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题细菌内毒素检查方法建立小应注意的几个问题审评四部王彦厚摘要：木文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。关键词：细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种冇效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法吋，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。在建立

2、细菌内毒素检查法Z前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：冇关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒索检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时述应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和冇效性研究中增加剂量留出空间。一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒索检查方法时，首先应根据人体最人口给药剂量和给药途径，计

3、算和确定样品的内毒素限值，选择合适的蜜试剂，根据临床规格,计算最大冇效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。1、细菌内毒索限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的耍求？样品的内毒素含量貝体是多少？这些问题不但关注用药安金，还应该最大限度的捉供冇关内毒素含量的准确信息，为药晶牛产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终口的述是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值

4、的合理性，考虑技术口丁能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最人人用剂最确定一个非正式的限值,这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得止式生产时很多产甜不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。样品内毒素限值的确定-•般与临床人体最人给药剂最有关，剂最越人，单位重最或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/Mo式中内毒素限

5、值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大对耐受的内毒素剂量,以EU/(kg.h)表示，注射剂K=5EU/(kg.h),其中放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg.h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg.h)o-般我国人群平均体重按60炬计算，人体対细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最人耐受剂量为(300EU/h)/1.55m2=(193EU/h)/m2。M为人体每公斤体重每小吋接受的最大给药剂量,以ml/(kg.h)>mg/(kg.h

6、)或u/(kg.h)表示。内毒素限值计算举例(一)：A注射剂的人体最人用量为每小时1.5g,每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg,内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/(25mg/kg)=0.2EU/mgo在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和卷试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限用可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml(或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml)，那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml吋，内毒素限值L=

7、0.2EU/mg100mg/ml=20EU/mL内毒素限值计算举例(二):B注射剂的临床最大用药剂量为lg/m2,规格为50mg/ml,内毒素限值L=(193EU/m2)/(lg/m2)=193EU/g=0.193EU/mg,转换为EU/ml表示时,L=0.193EU/mg50mg/ml=9.65EU/mlo大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml,灭菌注射用水则定为0.25EU/mlo内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品小内毒素的含量远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准严于注册标准，所以药典内毒索限值也被称为最大允许内毒素

8、浓度(Maximumallowableendotoxinconcentration)。2、样品最大有效稀释倍