内质网应激相关蛋白在百草枯致大鼠急性肺损伤中的变化

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1、内质网应激相关蛋白在百草枯致大鼠急性肺损伤中的变化DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.012基金项目：辽宁省教育厅高等学校科研基金资助项目（L2010682）作者单位：110004沈阳，中国医科大学附属盛京医院急诊科通信作者：戢新平，Email：jxpwh_ok@163.com百草枯（paraquat，PQ）又名对草快，其20%的溶液称克无踪，是一种有机杂环类触杀、灭生型高毒性除草剂。人类误服百草枯后，无特效解毒剂，中毒病死率极高[1]，其主要死因早期为急性肺损伤[2]，后期进展为不可逆性肺纤维化[3]。百草枯中毒的

2、发病机制尚未完全清楚[4]，大量研究显示细胞凋亡参与百草枯所致的急性肺损伤[5]。本研究通过建立百草枯中毒大鼠的急性肺损伤模型，初步探讨内质网应激途径介导的细胞凋亡在百草枯诱导的大鼠急性肺损伤中的作用。1材料与方法1.1实验动物7健康SPF级Spragne-Dawley（SD）大鼠80只，雄性（由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供），体质量200～250g。1.2主要试剂与仪器20%百草枯水溶液购于中国先正达南通作物保护有限公司（用无菌生理盐水将1mL克无踪稀释至100mL混匀，配制成2mg/mL溶液）；兔抗葡萄糖调节蛋白78（glucose-regula

3、tedprotein，GRP78）、兔抗生长停滞和DNA损伤诱导基因153（C/EBPhomologyprotein/growtharrestandDNAdamage-induciblegene，CHOP/GADD153）多克隆抗体购自美国CellSignaling公司；GAPDH多克隆抗体购自美国CellSignaling公司；超敏二步法免疫组化检测试剂购自中国北京中杉金桥生物技术有限公司。显微镜型号：日本NikonE800。1.3方法1.3.1动物分组与模型建立根据预实验结果设计，因染毒组在实验过程中有死亡，故增加实验动物数量，以保证所观察的各个时间点动物数

4、量相同。SD大鼠随机（随机区组法）分为对照组（40只）、百草枯染毒组（40只）。①百草枯染毒组（简称PQ组）：按20mg/kg计算，腹腔注射配制的百草枯溶液；②对照组：给予0.9%的无菌生理盐水（NS）等量腹腔注射。对照组及染毒组于给药后8h、1d、3d、5d各处死10只大鼠。左肺用4%多聚甲醛固定，HE染色及免疫组织化学测定；右肺迅速-80℃冷冻保存，行Western7blot蛋白测定。1.3.2病理学检查肺组织用4%多聚甲醛溶液固定后，常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，光镜下观察肺组织病理改变。1.3.3Westernblot法检测GRP78、

5、CHOP蛋白表达取各组大鼠肺组织各100mg，加入1mL组织蛋白裂解液后剪碎组织，匀浆机将组织超声裂解后，取匀浆液4℃15000r/min离心20min。取上清液，BCA法蛋白定量。取50μg蛋白变性，上样，经10%SDS-PAGE凝胶电泳。湿转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭1h后，分别加入兔抗大鼠GRP78多克隆抗体（1∶1000稀释）、兔抗大鼠CHOP多克隆抗体（1∶1000稀释）和GAPDH（1∶2000稀释）4℃振荡孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶2000稀释）室温1h。TBST洗涤后，利用ECL超敏

6、发光液，X线胶片曝光、显影。以GAPDH为内参照。采用分子生物学图像分析系统进行定量扫描测定条带灰度值，将每个样本的灰度值与相应GAPDH的灰度值相比，计算蛋白的表达水平。1.3.4免疫组织化学法检测GRP78、CHOP蛋白表达取石蜡切片（4μm），常规脱蜡、水化。滴加3%H2O2去离子水室温孵育207min，柠檬酸盐缓冲液微波加热修复抗原，滴加一抗（兔抗大鼠GRP78、CHOP多克隆抗体，抗体稀释的工作浓度均为1∶200，另外采用PBS代替一抗的方法制备阴性对照）4℃过夜。滴加PolymerHelper的二抗37℃30min，滴加poly-HRPanti-Ra

7、bbitIgG37℃30min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。显微镜下照相，采用全自动图像分析系统（NIS-ElementsBr3.0）分别计算其平均光密度，取其均值分析。1.4统计学方法计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS17.0软件分析，单因素方差分析法比较多个样本均数、LSD-t检验法进行均数之间的两两比较，以P2.2大鼠肺组织中GRP78、CHOP蛋白表达对照组8h、1d、3d、5d中GRP78/GAPDH灰度比值为（0.78±0.0339、0.76±0.0491、0.771±0.0533、0.775

8、±0.0313），PQ组