mtt实验法测定细胞增殖

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1、MTT实验法测定细胞增殖1.实验材料1.1.实验细胞株癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔2～3天进行一次细胞传代。1.2药物与试剂RPMI-1640培养基DMSO胰蛋白酶粉1-甲基乙内酰脲5-氟尿嘧啶MTT粉甘油碘化丙啶(PI)新生小牛血清1.3仪器设备超净工作台（SW-CJ-2FD型）超低温电冰箱恒温水浴箱低温高速离心机恒温震荡摇动床-20℃电冰箱光学显微镜电子天平Eppendorf移液枪（10、100、1000ul）去离

2、子纯水仪流式细胞仪低温数控高速离心机普通离心机1.4主要试剂配方1.4.1PBS溶液磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、氯化钾(KCl)0.2g，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为1.0L。再使用盐酸将PH值调至7.4，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4℃内保存。临用前要在37℃水浴加热。1.4.2细胞培养基称取RIPM-1640培养基粉10.4g，用1.0LddH2O溶解，再往溶液中加入2gNaHCO3，再用盐酸将

3、PH值调整至7.0，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为10%。每次临用前要将含有10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640培养基置于37℃水浴箱中加热。1.4.3新生小牛血清临用前，将新生小牛血清置于56℃水浴中灭活30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20℃冰箱中保存。1.4.4胰蛋白酶在100ml的PBS溶液中加入胰蛋白酶粉0.25g，置于4℃冰箱中过夜，用直径为0.22μm微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封

4、，置于4℃冰箱中保存。1.4.5MTT溶液(5mg/ml)往50ml无菌PBS中加入250mgMTT粉，轻轻摇匀，使MTT粉充分溶解，予用直径为0.22μm微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于4℃冰箱中临时保存（≤7天），置于-20℃冰箱中短期保存（≤1月）。1.4.64%多聚甲醛称取多聚甲醛4g溶于50ml蒸馏水中，然后加热至70℃左右，用玻璃棒搅拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然后往溶液中逐滴加入浓度为1mol/L的Na0H至溶液澄清，冷却，蒸馏水定容至100ml，用盐酸将PH调至7.2，锡箔纸避光，

5、置于4℃冰箱中保存。1.4.7苏木精染液蒸馏水700ml，甘油300ml，苏木精5g，碘酸钠0.5g，冰醋酸20ml，硫酸铝钾500g。1.4.8伊红染液蒸馏水100ml，伊红0.5g，氯化钙0.5g。1.4.91-甲基乙内酰脲溶液的配制1-甲基乙内酰脲（M）分子式为C4H6N2O2，分子量为114.10，纯度>99.0%，吸取适量该药物，加入少量PBS或生理盐水（PH7.4），配制成500mg·L-1的母液。-20℃保存，临用时稀释。1.4.105-Fu溶液的配制5-氟尿嘧啶（5-Fu）分子量为130.

6、08，分子式为C4H3FN2O2，规格为250mg/10ml，pH值为8.4～9.2，吸取适量该药物，加入少量PBS或生理盐水（PH7.4），配置成100mgL的母液。-20℃保存，临用时稀释。2.实验方法.2.1.细胞培养2.1.1.细胞复苏(1)从-80℃冰箱迅速取出冻存人结肠癌SW480细胞的冻存管，然后迅速投入37℃水浴箱中，轻轻摇动冻存管，使冻存管内容物迅速融化，取出后用75%酒精消毒，放入无菌操作台，在操作台中开启冻存管。用1000ul的移液枪吸出溶解的细胞悬液，注入离心管，同时往离心管中加入

7、10倍10%灭活新生小牛血清RPMI-1640培养基，准备离心。(2)室温下，1000rpm，离心5min，用移液枪吸取离心管中上清液、弃去，然后用细胞培养液洗1～2次，弃去上清培养液后，加入1ml培养液，用吹打管轻轻吹打，使离心管底部的细胞悬于培养基中，形成悬浮液。(3)用培养液适当稀释悬浮液后，用移液枪将细胞悬液接种到100ml的无菌培养瓶，盖好瓶盖，将接种有人结肠癌SW480细胞的培养瓶放入饱和湿度、5%CO2、温度为37℃培养箱中培养，24h后更换培养液，放入培养箱中继续培养，观察细胞的生长状况，

8、待细胞生长状态基本恢复正常后，取对数期细胞进行实验。2.1.2.细胞传代(1)在普通光学显微镜下观察观察细胞的生长状况，当细胞在培养瓶贴壁面生长融合达70%～80%时，弃去培养液，然后用PBS液洗1～2遍。(2)(2)用0.25%胰酶细胞消化液，于室温或37℃下消化铁壁细胞数分钟，边消化边在显微镜下观察细胞的形态变化，当70%细胞的胞膜发生皱缩，细胞体积变小、细胞变圆时，往培养瓶中加入10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640