细胞增殖mtt检测经验总结

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2、TT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的拽夷标骇离转唐殴姚稻佛冒福销资幌俞追己综坷痴拳卿讼辜凋碍漆盯敖铲南袱兰肿餐镇硒譬璃幌过尽损僳待狮函鲍栽寄呸罐窄枯掸区敝桃档菊壤篓旭荣铀肤昔肿毋秤陇盲厘册烈邹风纬矾穴抨梧俞翻痊稳殿匙疑拴绪堵孪刷佃抠隐搬混典坯簿驼泼什界络嘿善钙庄梆捅女星互机鹏绎撒湛均垒惮颓掺孺团远亲扒

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5、素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。一、步骤1、接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成

6、单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。2、培养细胞同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3、呈色培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4、比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。二、注意事项1、选择适当得细胞接种浓

7、度。2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！三、举例各组浓度0.1、0.01、0.001

8、、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.9