真核细胞dna提取与酶切鉴定-liuchang

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1、离心分子生物学技术电泳层析光学生化实验生物化学实验的主要技术生化实验内容安排实验室实验内容一实验16：DEAE纤维素离子交换层析二实验17：血清-γ球蛋白的提纯实验8：醋酸纤维素薄膜电泳三实验9：聚丙烯酰胺凝胶电泳四实验3：测定蛋白质的比色分析法实验12：血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳五实验18：真核基因组DNA的分离提取六实验7：酶促反应动力学实验第一轮第二轮：考试（6个实验室）实验本身:实验室规则:时间、穿着、仪器不能乱动、赔偿制度、整洁、卫生。实验报告（如实记录）规范操作（辨认标签…）、污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗）规则实验实验报告要求：题目，组号实验目的实验原理

2、实验操作：如实记录实验结果及结果分析：实事求是讨论或小结：认真分析，仔细思考2021/6/225真核细胞基因组DNA的分离提取及酶切电泳实验目的1.掌握人外周血基因组DNA的提取原理、原则、提取方法和注意事项，熟悉外源基因的基本制备方法。2.学习琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和技术。基因组DNA提取的操作流程〖实验步骤〗１、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5mlEppendorf离心管中。抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素２、加入1mlSTMT，充分混匀使其溶血。STMT（破坏细胞膜)葡萄糖：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。Tris·HCl:不

3、含金属离子,与EDTA更能稳定DNA的活性。TritonX-100:非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及细胞核。MgCl2:提供Mg2+，稳定DNA。３、10000g离心2min，弃上清。注意离心机的使用⑴配平⑵上清丢弃到废液缸，尽量空净。4、用0.4ml生理盐水洗沉淀，10000g离心2min，弃上清。注意离心机的使用⑴配平⑵上清丢弃到废液缸，尽量空净。５、加450μlNE溶液将沉淀重新悬浮。NENaCL:50mmol/LEDTA:1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2.降低细胞膜的稳定性６、加50μl10%SDS，迅速混匀;再加50μl蛋白酶K，轻轻摇

4、匀后置50℃水浴1h。SDS1.溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来3.对RNA、DNA酶有抑制作用4.与蛋白质形成R-O-SO3….R蛋白质复合物，使蛋白质变性蛋白酶K(或链霉蛋白酶)广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。７、加入TE饱合酚500μl，轻摇2min，10000g离心1min，将上层水相移至另一新Eppendorf管内。酚能有效地使蛋白质变性；酚不能抑制RNAase的活性；酚能溶解入10％一15％的水分。８、加入酚－氯仿－异戊醇混合液500μl，轻摇1min，10000g离心1min，将上层水相移至另

5、一Eppendorf管内。氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用不如酚。氯仿有助于加速有机相和水相的分离；使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一一种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复抽提，还可克服酚的缺点。９、加入氯仿－异戊醇混合液500μl，轻摇1min，10000g离心1min，将上层水相移至另一新Eppendorf管内。（定体积）移上清时要定量，宁少勿多氯仿：①将残留在水相中的酚带走②也可以再次使蛋白变性异戊醇：①降低分子表面张力，减少气泡产生②有助于分层上层为水相中间为变性的蛋白下层为有机相10、向上清中加入1/10体积的NaAc，并混匀。再加入2倍体积的冰冻无水乙醇，

6、充分混匀，于－80℃放置10min。核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、镁等很多1价、2价阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用的沉淀剂为1价钠、钾、铵和锂等离子盐类，如醋酸钠、氯化钠等。常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。11、10,000g离心5min，弃上清,将小管倒置于滤纸上。室温干燥5min。12、加入20μl双蒸水溶解基因组DNA。基因组DNA8μl10X缓冲液1μlEcoRⅠ1μl离心甩一下，37℃温浴1h。另外剩余的10μl留做电泳分析用。酶切体系酶切注意事项按顺序加样，每加一个样品更换一次tip头一定要将酶加进去加酶的时候一

7、定保证低温，在冰上操作加完后要充分混匀，用离心机“甩”一下再水浴（配平后，随意调时间，将转速调到接近最大值，即刻再调回零）13、1％琼脂糖凝胶电泳检测10μL酶切后基因组DNA2μL10×Loadingbuffer12μL基因组DNA2μL10×Loadingbuffer1×TBE恒压100V电泳0.5-1h实验原理核酸：包括DNA、RNA两种分子。DNARNA多呈单链线性分子双链线性分子双链环状分子真核生物DNA95%