DBS22027-2014食品安全地方标准食品中肠球菌的定性定量检验.pdf

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1、DBS22吉林省地方标准DBS22/027—2014食品安全地方标准食品中肠球菌的定性定量检验2014-07-30发布2014-08-30实施吉林省卫生和计划生育委员会发布DBS22/027—2014吉林省食品安全地方标准食品中肠球菌的定性定量检验1范围本标准规定了食品中肠球菌（Enterococcus）的检验方法。本标准适用于食品中肠球菌的定性定量检验。2术语和定义肠球菌（Enterococcus）一类革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，无芽胞和荚膜，可分解胆汁七叶苷。是评估食品、水、食品加工设备、食品生产环境等卫生状

2、况的指标菌之一。3设备与材料除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：3.1冰箱：0℃～4℃。3.2恒温培养箱：36℃±2℃、45℃±2℃。3.3显微镜：10×～100×。3.4全自动细菌生化鉴定系统。3.5均质器。3.6过滤装置：抽滤瓶、真空泵和耐高温处理的过滤器。3.7天平：感量0.1g。3.8酒精灯和接种环。3.9无菌剪刀、勺子、镊子。3.10无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。3.11滤膜：直径47mm,微孔径0.45mm±0.02mm。3.12无菌试管：18mm×180mm、15mm×100m

3、m及相应的试管架。3.13无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL具0.1mL刻度）。3.14无菌锥形瓶:容量500mL。3.15无菌培养皿：直径90mm。4培养基和试剂4.1叠氮化钠葡萄糖肉汤:按附录中A.1。4.2肠球菌肉汤:按附录中A.2。4.3KF链球菌琼脂:按附录中A.3。4.4肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）:按附录中A.4。4.5胆汁七叶苷琼脂（BEA琼脂）:按附录中A.5。4.6脑心浸液肉汤(BHIB):按附录中A.6。1DBS22/027—20144.7含6.5%氯化钠脑心浸液肉汤:

4、按附录中A.7。4.7.1脑心浸液琼脂(BHIA):按附录中A.8。4.7.2过氧化氢酶试验：按附录中A.9。4.7.3革兰氏染色液按附录中A.10。4.7.4VitekGNI＋全自动微生物生化鉴定系统测试卡或API20strep试剂条。（由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标本的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。）第一法平板计数法5平板计数法实验原理应用倾注法，根据样液在选择性肠球菌琼脂（36℃±2℃培养18h～24h）或KF琼

5、脂（36℃±2℃培养24h～48h）上生长的典型菌落数，经确证实验证实为肠球菌的菌落数可换算为每克或每毫升样本中肠球菌数。此方法适用与未经加工处理的生鲜食品或污染情况可能较重的水和食品。6平板计数法检验程序平板计数法检验程序如图1：检样25g(mL)样品＋225mL生理盐水，均质10倍系列稀释选择2个～3个适宜稀释度，各取1mL分别加入肠球菌琼脂或KF琼脂36℃±2℃24h～48h确证实验菌落观察染色镜检生化实验或Vitek或API计数并报告结果图1肠球菌平板计数法检验程序7平板计数法操作步骤2DBS22/02

6、7—20147.1样品保存采样后应尽快进行检验，若不能及时检验，应放于﹣18℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应冷藏保存的待检样品在运送实验室后应1℃～4℃冰箱保存。样品采集后8h内要完成检验。7.2样品处理7.2.1固态样品：以无菌操作称取25g检样，放入含有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯或均质袋或灭菌乳钵中，使用旋转刀片式均质器均质(800～1000r/min)2min或拍击式均质器均质2min或充分研磨做成1:10稀释液。7.2.2液态样品：以无菌操作量取25mL检样，放

7、入含有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯或均质袋中，振荡混匀。7.2.3样品稀释：取1:10稀释液1mL加到含有9mL无菌生理盐水的稀释瓶中,充分混匀制成1:100的稀释液。根据对样品的污染状况的估计,依次制成十倍递增稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。7.3定量检测7.3.1接种和培养根据样品的污染程度估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度的稀释液各1mL加入无菌培养皿内,每个稀释度做2个平皿。把融化45℃±1℃的肠球菌琼脂或KF琼脂12mL～15mL倾入培养皿内，转动平板充分混合，水平

8、放置，使琼脂凝固。可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层肠球菌琼脂或KF琼脂（约4mL），凝固后翻转平板。肠球菌琼脂置于36℃±2℃培养18h～24h；KF平板置于36℃±2℃培养24h～48h。同时分别取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。7.3.2典型菌落观察在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐，用无菌接种针从每个肠球菌琼脂平板