三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用

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1、三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用【关键词】瘢痕;成纤维细胞;三七总甙;钙离子　　[ABSTRACT]Objective:Toobservetheeffectofthepanaxnotoginsengsaponins(PNS)ontheintracellularfreecalciumcontentrationinhumanhypertrophicscarfibroblastsinvitro.Methods:ThehypertrophicscarfibroblastsLconcentration).Thein

2、tracellularfreecalciumconcentrationicroscopy.Results:paredconcentrationent(P<0.05),andthereconcentrationinhumanhypertrophicscarfibroblastsanner.　　[KEYEM(美国HYCLONE公司)，医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ875型)，二氧化碳培养箱(美国SHELLAB1815TC型)，倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂XSJD型)，Olympus光学显微镜，激光扫描共聚焦

3、显微镜(德国)。　　1.2实验方法　　1.2.1人增生性瘢痕成纤维细胞体外培养实验所用瘢痕组织均为北京军区总医院烧伤整形科的烧伤后瘢痕患者手术所取的标本，均为烧伤创面愈合3个月以上，瘢痕仍持续增生者，共6例。瘢痕的特点：外观发红充血、质硬、高于皮面1cm以上，瘢痕增生局限于皮损区，局部伴瘙痒或疼痛等不适。瘢痕处于增生活跃期，患者无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，无心、肺、肝、肾等慢性疾病，6个月内未使用类固醇激素类药物、抗肿瘤药物等，且未曾接受放疗者。采用组织块法进行原代培养。实验所用为3～5代的人增生性瘢痕成纤

4、维细胞。在倒置相差显微镜下观察细胞形态。　　1.2.2三七总甙干预人增生性瘢痕成纤维细胞实验分3组：空白对照组、400μg/mLPNS给药组、800μg/mLPNS给药组。取第4代人增生性瘢痕成纤维细胞，将细胞按常规方法消化，调整细胞密度为1×105/mL，分别接种于3块含盖玻片的6孔培养板中，进行细胞爬片，8h后更换培养液，空白对照组加入新配制的10%小牛血清DMEM培养基，400μg/mLPNS给药组加入终浓度为400μg/mL的三七总甙，800μg/mLPNS给药组加入终浓度为800μg/mL的三七总甙。　　1.2.

5、3钙离子动态变化的测定Fluo3/AM荧光探针用纯二甲基亚砜(DMSO)配成1mmol/L的储备液，低温保存备用。非离子型多元醇表面活性剂pluronicF127用DMSO配制成25%溶液(用DHanks液稀释至5μmol/L，并加入配制好的F1274μL助溶，加于培养的人增生性瘢痕成纤维细胞样品上，置于5%CO2孵箱中孵育1h。将负载后的小玻片转移到激光共聚焦显微镜的细胞槽内，加入1mL缓冲液，选择细胞及层面，用激光共聚焦显微镜观察。Fluo3/AM激发波长为488nm，发射波长为525nm，扫描方式选择时间扫描

6、，激光功率选择30min。实验条件在整个观察过程中不变。随机选择3～4个细胞动态扫描细胞内Ca2+的荧光吸光度。先扫描记录一段正常波动曲线，再加入药物。Fluo3/AM染色的细胞内Ca2+浓度变化时，荧光强度会发生改变，Ca2+浓度越高，荧光强度越大。利用激光共聚焦显微镜所配备的数据与图像处理软件，计算出整个细胞荧光强度的相对值，以观察Ca2+动态变化;细胞内Ca2+浓度变化用给药前、后荧光强度变化计算方法：[Ca2+]i=(FF0)/F0×100%，其中F表示给药后的荧光强度，由包括峰值在内的3个测定值确定，F0表示

7、静息状态的荧光强度，由平台期3个时间点的测定值确定。　　1.3统计学处理　　实验所有计量数据用平均数和标准差(±s)来表示，并采用SPSS10.0统计软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，比较组间差异;两两比较用Turkey方法，P<0.05为统计学差异显著，P>0.05为无统计学差异。　　2结果　　2.1倒置相差显微镜下观察细胞形态　　人增生性瘢痕成纤维细胞在倒置显微镜下观察呈典型长梭形，胞体较大，部分细胞可见向外伸出2～3个长短不一的突起，胞体的两极细长，细胞走向趋于一致，依靠紧密且排列整齐，为典型的

8、成纤维细胞。加入三七总甙处理后，随着药物浓度增大、作用时间延长，活细胞数量逐渐减少，细胞间隔增宽。细胞突起明显缩短，呈多角型，甚或消失。细胞变圆，胞体缩小。细胞质减少，有的呈空泡状，染色质浓缩边聚，胞核模糊或断裂成块状，见图1、2。　　2.2三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用　　不同浓度