rna干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅱa（myh9）表达的研究

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1、RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）表达的研究：黄娅琳,寇俊萍,宋佳希,余伯阳【摘要】　　目的:构建人MYH9（非肌肉肌球蛋白重链ⅡA）的siRNA表达体系,抑制原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）MYH9基因的表达。方法:针对人MYH9基因序列,构建siRNA表达质粒,通过酶切和测序鉴定确定其序列正确性。分别转染重组质粒pGCsiMYH91/2/3至HUVEC细胞,通过半定量RTPCR和蛋白质印迹,分别检测在转染后24h、48h、72hMYH9在mRNA转录水平及蛋白表达的变化。结果:在构建的3种重组质粒中,pGCsiMYH92、pGCsiMYH93在转

2、染后24h均表现出一定的干扰作用,转染后48h干扰作用最强,转染后72h干扰作用减弱;pGCsiMYH93的干扰作用最明显,转染后48h,能明显下调HUVEC的MYH9蛋白表达,抑制率平均可达71.2%,此时MYH9基因mRNA转录明显减少,抑制率为86.5%。结论:在转染后48hpGCsiMYH93可明显抑制HUVEC细胞内源MYH9的表达,为进一步研究MYH9在相关疾病中的功能奠定基础。　　AIM:ToconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinRNA(shRNA)andtoinvestigateitsefficacyinsilencingn

3、onmusclemyosinheavychainⅡA(MYH9)gene.METHODS:AccordingtotheMYH9cDNAsequenceinGenBank,threeshRNAexpressionvectorstargetingMYH9geneedbydigestionesandDNAsequencing.TherebinantplasmidsinedbysemiquantitativeRTPCRatmRNAlevelandbyRNAandproteinlevelsgraduallybecamemoreevidentfrom24hto48h,andachievedthemax

4、imaldegreeat48h,thenbecameongthesethreeplasmids.TheintroductionofpGCsiMYH93RNAtranscriptionofMYH9geneidpGCsiMYH93couldinhibitMYH9expressioninHUVECcellssuccessfullyandeffectively,iseditsfurtherapplicationinrelatedfunctionanalysisofMYH9.【关键词】RNA干扰;人脐静脉内皮细胞（HUVEC）;非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）　　非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（non

5、musclemyosinheavychainⅡA,NMHCⅡA,MYH9）是一种由人第22号染色体上的MYH9基因编码的蛋白,它广泛分布于血管内皮细胞、巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞等多种细胞,与胞质分裂［1］、肿瘤转移［2,3］、血小板活化和血栓形成［4］、血管收缩［5］等密切相关。同时,血管内皮细胞在上述生理病理过程中发挥重要作用,但有关MYH9在血管内皮活化中的作用,尚未得到有效阐明。而利用RNA干扰(RNAi)技术可以较容易地制备特定基因缺失表型的个体,表达shRNA片段的RNAi载体可以在体内外特异性高效抑制相关基因,方便快捷地研究该基因的功能［6-8］。因此,本研究旨在构建针对人M

6、YH9基因的shRNA表达载体,筛选出抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）MYH9表达的最佳转染质粒和最佳转染时间,为进一步研究MYH9的功能提供技术手段,为深入阐释MYH9在血管内皮细胞活化相关的心脑血管疾病、肿瘤转移等重大疾病中的作用奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料M199培养基、胎牛血清、TRIzol、反转录试剂盒均购自Gibco公司。pGCsilencerTMU6/neo/GFP/RNAi表达质粒载体、阴性对照质粒pGCsi.U6/neo/GFPNON、阳性对照质粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP)均购于上海吉凯生物技术公司。shRNA插入模板寡核苷酸由TaKaRa公

7、司合成。限制性内切酶、连接酶、DNAMarker、PCR相关试剂均购自TaKaRa公司。脂质体LipofectamineTM2000、DNA片段纯化试剂盒、OPTIMEMI培养基、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自Invitrogen公司。内皮细胞生长因子（ECGS）、兔抗人MYH9多抗购自Sigma公司,其余抗体均购自博士德公司。BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司。ECL试剂盒购自Pier