rna干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅱa（myh9）表达的研究

《rna干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅱa（myh9）表达的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）表达的研究作者：黄娅琳,寇俊萍,宋佳希,余伯阳【摘要】　　目的:构建人MYH9（非肌肉肌球蛋白重链ⅡA）的siRNA表达体系,抑制原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）MYH9基因的表达。方法:针对人MYH9基因序列,构建siRNA表达质粒,通过酶切和测序鉴定确定其序列正确性。分别转染重组质粒pGCsiMYH91/2/3至HUVEC细胞,通过半定量RTPCR和蛋白质印迹,分别检测在转染后24h、48h、72hMYH9在mRNA转录水平及蛋白表达的变化。

2、结果:在构建的3种重组质粒中,pGCsiMYH92、pGCsiMYH93在转染后24h均表现出一定的干扰作用,转染后48h干扰作用最强,转染后72h干扰作用减弱;pGCsiMYH93的干扰作用最明显,转染后48h,能明显下调HUVEC的MYH9蛋白表达,抑制率平均可达71.2%,此时MYH9基因mRNA转录明显减少,抑制率为86.5%。结论:在转染后48hpGCsiMYH93可明显抑制HUVEC细胞内源MYH9的表达,为进一步研究MYH9在相关疾病中的功能奠定基础。　　AIM:Toconstruct

3、theexpressionvectorofsmallhairpinRNA(shRNA)andtoinvestigateitsefficacyinsilencingnonmusclemyosinheavychainⅡA(MYH9)gene.METHODS:AccordingtotheMYH9cDNAsequenceinGenBank,threeshRNAexpression15vectorstargetingMYH9genewereconstructedandwereconfirmedbydigestionwithr

4、estrictionenzymesandDNAsequencing.TherecombinantplasmidsweretransfectedintoHUVECcells.TheexpressionofMYH9wasdeterminedbysemiquantitativeRTPCRatmRNAlevelandbywesternblottingatproteinlevelat24h,48hand72haftertransfection.RESULTS:ThedecreaseofMYH9expressionatmR

5、NAandproteinlevelsgraduallybecamemoreevidentfrom24hto48h,andachievedthemaximaldegreeat48h,thenbecameweakenedandrestoredat72h.TheefficiencyofpGCsiMYH93wasthebestamongthesethreeplasmids.TheintroductionofpGCsiMYH93wasshowedtoefficientlyandspecificallyinhibitt

6、heexpressionofMYH9withinhibitoryrateat71.2%accordingtoresultsofWesternblot.RTPCRresultsshowedthatmRNAtranscriptionofMYH9genewasreducedby86.5%at48hafterintroductionofpGCsiMYH93.CONCLUSION:PlasmidpGCsiMYH93couldinhibitMYH9expressioninHUVECcellssuccessfullya

7、ndeffectively,whichpromiseditsfurtherapplicationinrelatedfunctionanalysisofMYH9.【关键词】RNA干扰;人脐静脉内皮细胞（HUVEC）;非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）15　　非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（nonmusclemyosinheavychainⅡA,NMHCⅡA,MYH9）是一种由人第22号染色体上的MYH9基因编码的蛋白,它广泛分布于血管内皮细胞、巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞等多种细胞,与胞质分裂［1］、肿瘤转移［2,3］、血

8、小板活化和血栓形成［4］、血管收缩［5］等密切相关。同时,血管内皮细胞在上述生理病理过程中发挥重要作用,但有关MYH9在血管内皮活化中的作用,尚未得到有效阐明。而利用RNA干扰(RNAi)技术可以较容易地制备特定基因缺失表型的个体,表达shRNA片段的RNAi载体可以在体内外特异性高效抑制相关基因,方便快捷地研究该基因的功能［6-8］。因此,本研究旨在构建针