非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a、b单克隆抗体的制备与鉴定

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1、山东农业大学硕士学位论文非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A、B单克隆抗体的制备与鉴定姓名：吴海珍申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：周恩民20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的猪的重要传染病之一，临床上主要表现为妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。目前，PRRS已遍及全球主要养猪国家和地区，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV进入细胞的过程是依赖受体实现的

2、，目前已鉴定的PRRSV的细胞受体有4个：硫酸乙酞肝素HS、唾液酸粘附素Sn、CDl63及波形蛋白Vimentin。HS主要是吸附PRRSV到易感细胞上，Sn介导PRRSV的内吞，CDl63协助Sn内吞并介导PRRSV复制的脱衣壳、释放过程，Vimentin与其它中间丝蛋白组成多聚体参与PRRSV在细胞内的复制和迁移。非肌肉肌球蛋白II型(NonmusclemyosinII，NM．II)广泛存在于肌细胞和非肌细胞中，在细胞迁移、细胞吸附、胞质分裂及胞内物质运输等发挥着重要的作用。非肌肉肌球蛋白II型重链(NonmusclemyosinheavychainII，NMHC

3、．II)可分3种亚型：NMHCII—A、NMHCII．B和NMHCII—C，三者氨基酸同源性达60％一80％的，但其氨基端和羧基端氨基酸序列存在明显差异，可据此制备特异性抗体识别不同亚型。本实验室利用PRRSVGP5蛋白的单克隆抗独特型抗体(MAb2．5G2)在Marc．145细胞中检测到NMHCII．A并进行探究，研究结果证明NMHCII．A羧基端蛋白可以降低PRRSV对Marc．145细胞的感染力，而NMHCII．B羧基端蛋白能够显著增强PRRSV感染细胞。这些研究结果表明：NMHCII．A、NMHCII．B在PRRSV感染Mare．145细胞过程中发挥作用。本研

4、究通过蛋白纯化、免疫BALB／cd、鼠、细胞融合与亚克隆技术，成功获得了针对NMHCII．A及NMHCII．B羧基端蛋白的单克隆抗体，均属于IgG亚类。这些单克隆抗体对相应抗原表现出高度特异性，相互之间不存在交叉反应。I-ELISA和westernblot结果确定NMHCII．A的单克隆抗体结合域在NMHCII．A1812．1894AA处，NMHCII．B的单克隆抗体抗原结合域在NMHCII．B1759．1903AA处；叠JJHELISA实验显示各单克隆抗体的抗原结合表位相同或相近。通过制备小鼠腹水和抗体纯化技术，获得纯化单克隆抗体进行细胞实验。问接免疫荧光实验表明单

5、克隆抗体可以结合Marc．145细胞上的活性抗原，不同剂量的单克隆抗体与Marc-145细胞的结合力度与其浓度成正比：剂量越大，荧光信号越强。免疫沉淀实验进一步证实了单克隆抗体的生物活性。NMHCII．A及NMHCII．B羧基端蛋白单克隆抗体的制备为探究NMHCII-A、NMHCII．B与PRRSV之间的具体非肌肉肌球蛋白II型重链A、B单克隆抗体的制备与鉴定关系奠定了‘基础。一关键词：PRRSV；非肌肉肌球蛋白lI型重链A、B：单克隆抗体；特性鉴定n山东农业大学硕士学位论文PreparationandC’racterization0fMonoclona’Antilm

6、diesreparationanhaonoclonalAntiboiesraCterlZatlon0tJ：ⅥagainstNon-muscleMyosinHeavychainIIAandBAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isaseverediseasecausedbyPRRSvirus(PRRSV)．Itmainlyresultsinreproductivedisorder，suchaspremature，abortion，fetaldeath，mummyorweakgeneration．A

7、nditcouldinduceporcinerespiratorysyndromeatvarietyofageswithhighmortality．PRRShasbeenprevailedinthemajorpig—raisingcountriesanddistrictsintheworld，andcausedgreateconomiclosstotheworld’Shogindustry．TheprocessPRRSVgetintocellsisreceptorsdependent．Therealefourreceptorsidentifiedno