cd59基因突变在肿瘤逃逸中的作用

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1、CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用【摘要】　　目的构建CD59突变的重组体，研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase3表达的变化。方法采用重组聚合酶链反应定点诱变技术，将CD59的第39～41位氨基酸突变为色氨酸，克隆入pALTERMAX质粒，采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞。G418筛选稳定表达细胞克隆，用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株，用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase3表达的变化。结果酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组

2、质粒。转染突变CD59后Hela细胞内caspase3表达明显减少，与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义（t=2.846,P<0.01)。结论caspase3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径。【关键词】抗原CD59点突变肿瘤逃逸基因重组Hela细胞Caspase3　　［ABSTRACT］ObjectiveToconstructmutantCD59molecular,andstudythealleosisintheexpressionofcaspase3correlativeorapoptosisbrough

3、taboutbyCD59mutationinHelacells.MethodsUsingpolymerasechainreactionsitedirectedmutagenesis,theaminoacidofthe39thandthe41thmutatedtotryptophanes.MutantCD59DNAinsertedintothevectorpALTERMAXandtransfectedintotheHelacellsvialipofectaminemethod.StableexpressionclonesutantCD59mu

4、nofluorescencemethod,ELISAandfloetry.Theexpressionofcaspase3inHelacellsbeforeandaftertransfectionmunohistochemically.ResultsRebinantplasmidsofpALTERMAXCD59hadbeensuccessfullyconstructedaccordingtosequenceofenzymedigestionanalysisandfragmentinvestigation.Theamountofcaspas

5、e3inHelacellsalCD59,andthedifferenceorescapingmaybetheexpressionchangingofcaspase3.　　［KEYutagenesis;Helacells;Caspase3　　众所周知，肿瘤的免疫逃逸是导致治疗方案失败的重要原因[1]。至今为止，国内外学者对肿瘤逃逸的机制已有多方面的阐述。近年来，国外学者在肠道、卵巢及前列腺等多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的高表达。CD59是一种补体调节蛋白,其以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚着于多种细胞膜表面[4]，通过阻止补体攻膜复合物

6、(MAC)的装配保护宿主细胞免受补体介导的溶细胞作用[5,6]。近年来的研究显示，CD59与肿瘤的生长失控和转移密切相关[2,3]，但有关其与肿瘤逃逸的相关性研究目前尚未有定论。本文通过研究caspase3的表达变化，探讨CD59与肿瘤逃逸的相关活性位点，为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。　　1材料和方法　　1.1材料　　pALTERMAX、pALTERCD59由美国哈佛大学惠赠,EcoRⅠ酶、DNA聚合酶、T4连接酶均购自大连TaKaRa公司，细菌菌株E.coli.JM109为本室保存，小牛血清为天津灏洋生物制品科技责任有限公司产品，Try

7、psin（1∶250）购自SinoAmericanBiotec公司，RPMI1640培养基、G418选择抗生素、LipofectamineTM2000均为Invitrogen公司产品，鼠抗人CD59单抗为本实验室制备，羊抗鼠IgG2aFITC、羊抗人CD59单抗和HRP标记兔抗山羊IgG（H+L）均购自北京中山生物技术有限公司，荧光抗体CD59FITC购自COULTER公司，caspase3免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，Hela细胞由本实验室保存。设计两对寡核苷酸引物，通用引物：pT7，T3；突变引物：M/F，M/R。以

8、上引物均购自上海生物工程有限公司。　　1.2方法　　1.2.1重组真核表达载体的构建在原构建的重组质粒pALTERCD59的基础上,设计两对反向互补