cd59基因突变在肿瘤逃逸中的作用论文

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1、CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用论文【摘要】目的构建CD59突变的重组体，研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase3表达的变化。方法采用重组聚合酶链反应定点诱变技术，将CD59的第39～41位氨基酸突变为色氨酸，克隆入pALTERMAX质粒，采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞。G418筛选稳定表达细胞克隆，用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株，用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase3表达的变化。结果酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组质粒。转染突变CD59后Hela细

2、胞内caspase3表达明显减少，与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义（t=2.846,P0.01)。结论caspase3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径。【关键词】抗原CD59点突变肿瘤逃逸基因重组Hela细胞Caspase3［ABSTRACT］ObjectiveToconstructmutantCD59molecular,andstudythealleosisintheexpressionofcaspase3correlativeorapoptosisbroughtaboutbyCD59mutationinHelacells.MethodsU

3、singpolymerasechainreactionsitedirectedmutagenesis,theaminoacidofthe39thandthe41thmutatedtotryptophanes.MutantCD59DNAinsertedintothevectorpALTERMAXandtransfectedintotheHelacellsvialipofectaminemethod.StableexpressionclonesutantCD59munofluorescencemethod,ELISAandfloetry.Theexpressionofcaspa

4、se3inHelacellsbeforeandaftertransfectionmunohistochemically.ResultsRebinantplasmidsofpALTERMAXCD59hadbeensuccessfullyconstructedaccordingtosequenceofenzymedigestionanalysisandfragmentinvestigation.Theamountofcaspase3inHelacellsalCD59,andthedifferenceorescapingmaybetheexpressionchangingo

5、fcaspase3.［KEYutagenesis;Helacells;Caspase3众所周知.freelericanBiotec公司，RPMI1640培养基、G418选择抗生素、LipofectamineTM2000均为Invitrogen公司产品，鼠抗人CD59单抗为本实验室制备，羊抗鼠IgG2aFITC、羊抗人CD59单抗和HRP标记兔抗山羊IgG（H+L）均购自北京中山生物技术有限公司，荧光抗体CD59FITC购自COULTER公司，caspase3免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，Hela细胞由本实验室保存。设计两对寡核苷酸引物，通用引物：pT7

6、，T3；突变引物：M/F，M/R。以上引物均购自上海生物工程有限公司。1.2方法1.2.1重组真核表达载体的构建在原构建的重组质粒pALTERCD59的基础上,设计两对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物，由生物公司合成。其序列如下。通用引物pT7：5′TAATACGACTCACTATAGGC3′；通用引物T3：5′TATTCAGGCGTAGCAACCAG3′；突变引物M/F：5′GTGTATAACAAGTGGTGGTGGTTTGAGCATTGC3′；突变引物M/R：5′ATGCTCAAACCACCACCACTTGTTATACACTTG3′。以已构建的

7、CD59cDNA重组质粒为模板，以常规引物pT7和诱变引物M/R进行PCR1反应，以已构建CD59cDNA重组质粒为模板，以常规引物T3和诱变引物M/F行PCR2反应，将纯化PCR1和PCR2产物等量混合为模板，以通用引物pT7和T3行PCR扩增反应，从而得到所需的诱变位点的大量DNA片段，该突变可使CD59第39～41位氨基酸均突变为色氨酸。经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并回收目的条带。将质粒pALTER及含有全长突变CD59基因的PCR产物用EcoRⅠ单酶切后，经T4DNA连接酶作用，