hcv核心蛋白与hcbp1在哺乳双杂交系统中的相互作用

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1、HCV核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用【摘要】目的：探讨HCVcore与HCBP1的相互作用.方法：PCR分别扩增含HCVcore及HCBP1的cDNA片段，克隆入pGEMT载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中，并转染入COS7细胞，48h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平.结果：CATELISA检测显示pMcore与pVP16HCBP1实验孔A405nm值为0.1288，高于其它阴性对照，但低于阳性对照组A值.结论：哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1有一定

2、的相互作用，可进一步研究HCBP1的细胞功能.【关键词】HCV核心蛋白；哺乳双杂交；报告基因基金项目：国家自然科学基金（30471532）；陕西省科学技术研究发展计划项目（2004K15G1）　　　　【Abstract】AIM:ToanalyzetheinteractionbetammaliantentsencodingHCVcoreproteinandHCBP1plifiedbyPCRandsubsequentlyclonedintopGEMTvector,respectively.Afterverifiedbysequenci

3、ng,theyids,pMandpVP16.Then,pMcore,pVP16HCBP1andpG5CAT,areportervector,allentgroupmaliantsHCBP1canbindeextent.Basedonthis,ammaliantmalianMATCHMAKERTega公司），DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（大连宝生物公司）；DNA凝胶回收试剂盒Lipofectamine2000（Invitrogen公司），测序由上海生工生物工程有限公司完成.COS7细胞（中国科学院细胞库）;

4、PureYieldTMPlasmidMidiprepSystem（美国Promega公司）.　　1.2方法　　1.2.1PCR扩增克隆编码核心蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGAGCACGAATCCTAAACCTC3′；下游引物P2：5′GAATTCGGCTGAAGCGGGCACAGTC3′；以质粒pGBKT7HCVcore为模板，PCR反应条件为：94℃30s，50℃30s，72℃60s，共35个循环.克隆编码HCBP1蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGTGCTCACTGCCTGTGCCCCG

5、3′；下游引物P2：5′GGATCCGGAAGCTGGGCTCGGGGCAG3′；以肝cDNA文库为模板，PCR反应条件为：94℃60s，63℃60s，72℃60s，共30个循环.　　1.2.2PCR产物的克隆及鉴定回收的PCR产物与pGEMT载体相连，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选.用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及PCR鉴定后将含插入片段的阳性克隆分别命名为pGEMTcore及pGEMTHCBP1，进行序列分析.　　1.2.3表达载体的构建及鉴定用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pGEMTcore和表达载体pM，pGE

6、MTHCBP1和pVP16，回收coreprotein，pM，HCBP1及pVP16，载体与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5α，经限制性内切酶和PCR分析，含正确插入片段的克隆分别命名为pMcore和pVP16HCBP1，并用质粒提取试剂盒进行大规模的质粒提取和纯化.　　1.2.4转染COS7细胞于转染前1日将细胞用胰酶消化，计数并铺板，使转染当日细胞融合度为90%～95%.在铺板和转染期间避免使用抗生素.对每个转染样本进行如下操作：①在500μL无血清的培养基中稀释以下三种质粒共8.8μg，使pMcore质粒∶pVP16

7、HCBP1∶CAT质粒比例为5∶5∶1;②在每孔中，用500μL无血清培养基稀释22μL阳离子脂质体试剂，室温孵育5～10min;③将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混合，室温保温20min;④用1mL无血清培养基在转染前清洗细胞;⑤将质粒DNA与脂质体试剂的混合物加入细胞，37℃50mL/LCO2保温6h;⑥6h后弃去复合物，加入新鲜的完全培养基至正常体积;⑦转染48h后，弃去细胞培养液，用5mL冰预冷的PBS洗细胞3遍，最后小心弃去PBS;⑧加1mLlysisbuffer，室温30min;⑨将细胞溶解后置于1.5EP中，4℃，离

8、心10min;⑩吸取上清于-70℃迅速冷冻待检.实验同时设立阴性和阳性对照组.　　1.2.5报告基因表达的检测按CATELISAKit说明操作.①标准孔：每孔加入0，1.0，0.5，0.25，0.125mg/LCAT酶标准稀释液200