sd大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察

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1、SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察【关键词】大鼠;软骨细胞;单层培养;去分化　　Abstract:ObjectiveToestablishtheseparatingandculturingmethodsforratcostochondralchondrocyte(RCC),andtoinvestigatetheirmorphouschangesinthecourseofcellpassage.MethodsUnderthehelpofcollagenaseIIandtrypsinsdigestion,thescatteredsingleRCCorpholo

2、gicalchangesofRCCcellsculturedbymonolayercultureindifferentgenerationsmunocytochemicalmethodplemented.ResultsHighpuritycartilagecellsratcostalcartilagesafterdigestedbycollagenaseIIandtrypsin.Itedbyimmunohistochemistryandtoluidinebluestaining.ThededifferentiationofRCCcellsonolayerculture.

3、ConclusionsRCCcellscanbeamplifiedbypassageCulture,butonlyonolayerculture;dedifferentiation　　关节软骨损伤后，因局部血供缺乏，所以多年来一直被认为软骨细胞本身不具有修复与再生能力。1989年EM培基(Gibco公司);青霉素及链霉素(新华制药公司)CO2恒温培养箱(HERACell);兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(mAb)、PV两步法免疫组化试剂盒(购自北京中杉金桥生物有限公司)。　　1.2软骨细胞的采集选用新生3～5天的SD大鼠乳鼠1只，浸入75%的医用酒精中，5min×3次，处死并

4、消毒;无菌条件下取大鼠肋软骨，用PBS(含青、链霉素各100U/mL)冲洗2次，剔除软骨表面肌肉、骨膜及纤维组织，将软骨用眼科剪至1mm×1mm的碎块，加入3倍体积的0.25%的胰酶37℃消化半小时，中间吹打1次，弃掉胰酶后加入同胰酶相同体积的DMEM(含15%胎牛血清)终止消化，然后800r/min离心5min，弃上清加2倍体积的0.1%II型胶原酶消化4h，前3小时间每一小时晃动培养皿1次，观察大部分软骨块消化后，15min吹打1次，提取消化细胞悬液镜下观察细胞量足够多后经200目金属筛网过滤，1000r/min离心10min，去上清，再用培养基洗2次，用加入5mL

5、完全培养基(含15%小牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)重新悬浮细胞，将细胞接种于25mL的培养瓶中培养，标记为C1，留取部分悬液行台盼蓝染色计数并检测活细胞比例。　　1.3软骨细胞单层培养及生物学特性动态观察　　按2×104细胞/cm2的密度接种,37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，24h后更换培养液(含10%小牛血清),以后培养基每2d更换1次。当软骨细胞达到85%融合后以0.25%胰蛋白酶消化传代。再次接种密度仍为2×104细胞/cm2,传代培养条件与原代培养相同，并依次标记为C2……C6。倒置显微镜下观察每一代细胞的生长、形态变化、细

6、胞活力、分化融合的生物学特性形态并拍照记录。取生长状态良好的原代细胞进行生长状态观察，用0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个/孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共8日根据记数结果绘制细胞生长曲线。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘在坐标纸上，得到生长曲线。　　1.4甲苯胺蓝染色将0.5g甲苯胺蓝溶于100mLPBS中配成0.5%甲苯胺蓝溶液，将爬满软骨细胞的玻片用10%福尔马林固定1h，自来水冲洗15min，蒸馏水冲洗1次，甲苯胺蓝染色2～4h，75%乙醇冲洗1次，90%乙醇冲洗1次，95%乙醇冲洗1次，光镜下观察照相。　　1.5II型胶原免

7、疫组织化学染色将原代软骨细胞接种于6孔板中的盖玻片，95%乙醇固定15min，PBS洗涤，用75%乙醇固定30min，PBS洗5min，2次;加入5%BSA封闭液，常温下静置1h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加兔抗鼠一抗(1:100)，37℃孵育2h;PBS洗5min，3次;行SABC免疫细胞化学染色。直接参照SABC试剂盒操作方法进行显色。　　2结果　　2.1新生SD大鼠肋软骨原代细胞培养和形态学观察刚接种的原代软骨细胞倒置显微镜下观察大多成圆球形悬浮于培养液中;接种8h后大多数细胞呈圆形贴壁状态并开始展开(图1A);24h后细胞扁平且