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时间:2018-05-01
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1、探讨胸苷激酶基因在垂体腺瘤治疗中的作用机制 垂体腺瘤通常为良性肿瘤,约占原发性颅内肿瘤的15%. 垂体腺瘤可导致相关激素的过度分泌和占位效应,从而引发多种临床症状。转基因动物和细胞转染实验证实,生长激素(GH)mRNA在垂体细胞中严格表达且转录活性较高,而单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVGTK)与更昔洛韦共同作用已被证实可杀死多种肿瘤细胞。本文探讨TK基因在垂体腺瘤治疗中的作用及其机制。 1材料和方法 1.1实验材料 垂体生长激素腺瘤细胞系GH3由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。腺病毒载体AdGHTK
2、表达试剂盒购自上海吉马制药技术有限公司,核苷类似物更昔洛韦购自湖北科益药业股份有限公司。兔源多克隆HSVGTK抗体、HRP标记的goatantiGrabbitIgG购自北京博奥森公司。非放射性细胞增殖检测试剂盒购自武汉天源生物技术有限公司。 1.2实验方法 1.2.1细胞培养用含有体积分数0.05磷酸盐缓冲液(PBS)的Optimem培养液,在37℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养GH3细胞。待细胞增殖至对数生长期,用于以下研究。 1.2.2TK基因表达检测应用免疫印迹法。取对数生长期细胞,按1.5109/L的密
3、度接种于6孔板中,培养24h后,按感染复数(MOI)为10PFU/cell转染细胞,对照组替换成等量PBS溶液。细胞转染48h后,使用PBS冲洗细胞两次,再将细胞置于0.3mL的缓冲液中。将样品在干冰乙醇浴中冷却后置于37℃水浴,重复3次。4℃离心20min,上清液置于-70℃。 裂解细胞,提取蛋白,十二烷基硫酸钠G聚丙烯酰胺(SDSGPAGE)凝胶电泳后将蛋白质电转到硝酸纤维素膜上;用含50g/L脱脂奶粉的TBST常温封闭2h后,加入一抗兔源多克隆HSVGTK抗体(1∶800),4℃孵育过夜,TBST缓冲液漂洗10min
4、共3次后,加入二抗HRP标记的goatantiGrabbitIgG,常温1h;TBST缓冲液漂洗10min共3次;显色,压片,显影,定影。 1.2.3更昔洛韦敏感性检测应用非放射性细胞增殖检测试剂盒,测定转染过腺病毒的细胞对更昔洛韦的敏感性。取对数期细胞,以4106/L的密度接种于96孔板中,然后按不同的MOI(0、1、5、10、100和500PFU/cell)转染腺病毒载体。转染16h后,吸取病毒溶液,PBS清洗细胞,再添加不同浓度的更昔洛韦(0、1、5、10mg/L),每隔2d添加一次含有更昔洛韦的培养液。在添加更昔洛
5、韦后的第4天测定细胞存活率,实验重复3次。细胞存活率=给予更昔洛韦细胞的吸光度/未给予更昔洛韦细胞的吸光度。 1.2.4旁观者效应将转染了AdGHTK的GH3细胞和未经转染的GH3细胞分别以1∶4、2∶3、3∶2和4∶1的比例混合后,以4106/L的密度接种于96孔板中。培养1d后,其中一组加入浓度为10mg/L的更昔洛韦作为实验组,另一组加入等量PBS作为对照组,每隔2d添液一次。4d后检测细胞的存活率。细胞存活率=(细胞总数-死亡细胞数)/细胞总数100%. 1.3统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计分析,
6、计量资料结果用x±s表示,数据间比较采用析因设计的方差分析及成组设计的方差分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。 2结果 2.1TK基因的表达 AdGHTK转染组有两条明显的蛋白条带,相对分子质量分别为42000和46000;而对照组则仅有1条带,相对分子质量为42000(图1)。TK基因已转染入GH3细胞,并成功表达。【图1】 2.2TK基因对更昔洛韦敏感性影响 不同更昔洛韦浓度细胞存活率比较,差异有显着性(F=148160.215,P<0.001);不同MOI浓度细胞存活率差异
7、亦有显着性(F=275838.795,P<0.001);更昔洛韦浓度和MOI浓度间存在着显着的交互效应(F=14245.000,P<0.001).当MOI浓度为0时,细胞存活率不随更昔洛韦浓度的变化而变化;当MOI浓度为1~500PUF/cell时,细胞存活率随更昔洛韦浓度的增加而降低;当MOI浓度为10PUF/cell时,更昔洛韦浓度为1mg/L就产生细胞毒性(细胞存活率明显下降);当更昔洛韦浓度为10mg/L时,细胞产生完全毒性(细胞死亡率接近100%).转染细胞存在明显的敏感性。在高浓度MOI(100、50
8、0PUF/cell)下,即使更昔洛韦剂量很低,也会产生明显的细胞毒性。见表1.【表1】 2.3旁观者效应 未转染组细胞存活率为(98.51±2.16)%,1∶4混合转染组为(51.32±2.34)%,2∶3混合转染组为(11.23±2.07)%
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