探讨胸苷激酶基因在垂体腺瘤治疗中的作用机制

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1、探讨胸苷激酶基因在垂体腺瘤治疗中的作用机制　　垂体腺瘤通常为良性肿瘤，约占原发性颅内肿瘤的15%.　　垂体腺瘤可导致相关激素的过度分泌和占位效应，从而引发多种临床症状。转基因动物和细胞转染实验证实，生长激素（GH）mRNA在垂体细胞中严格表达且转录活性较高,而单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVGTK）与更昔洛韦共同作用已被证实可杀死多种肿瘤细胞。本文探讨TK基因在垂体腺瘤治疗中的作用及其机制。　　1材料和方法　　　　1.1实验材料　　　　垂体生长激素腺瘤细胞系GH3由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。腺病毒载体AdGHTK

2、表达试剂盒购自上海吉马制药技术有限公司，核苷类似物更昔洛韦购自湖北科益药业股份有限公司。兔源多克隆HSVGTK抗体、HRP标记的goatantiGrabbitIgG购自北京博奥森公司。非放射性细胞增殖检测试剂盒购自武汉天源生物技术有限公司。　　1.2实验方法　　1.2.1细胞培养用含有体积分数0.05磷酸盐缓冲液（PBS）的Optimem培养液，在37℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养GH3细胞。待细胞增殖至对数生长期，用于以下研究。　　1.2.2TK基因表达检测应用免疫印迹法。取对数生长期细胞，按1.5109/L的密

3、度接种于6孔板中，培养24h后,按感染复数（MOI）为10PFU/cell转染细胞，对照组替换成等量PBS溶液。细胞转染48h后,使用PBS冲洗细胞两次，再将细胞置于0.3mL的缓冲液中。将样品在干冰乙醇浴中冷却后置于37℃水浴，重复3次。4℃离心20min,上清液置于-70℃。　　裂解细胞，提取蛋白，十二烷基硫酸钠G聚丙烯酰胺（SDSGPAGE）凝胶电泳后将蛋白质电转到硝酸纤维素膜上；用含50g/L脱脂奶粉的TBST常温封闭2h后,加入一抗兔源多克隆HSVGTK抗体（1∶800）,4℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗10min

4、共3次后，加入二抗HRP标记的goatantiGrabbitIgG,常温1h;TBST缓冲液漂洗10min共3次;显色，压片，显影，定影。　　1.2.3更昔洛韦敏感性检测应用非放射性细胞增殖检测试剂盒，测定转染过腺病毒的细胞对更昔洛韦的敏感性。取对数期细胞，以4106/L的密度接种于96孔板中，然后按不同的MOI（0、1、5、10、100和500PFU/cell）转染腺病毒载体。转染16h后，吸取病毒溶液，PBS清洗细胞，再添加不同浓度的更昔洛韦（0、1、5、10mg/L），每隔2d添加一次含有更昔洛韦的培养液。在添加更昔洛

5、韦后的第4天测定细胞存活率，实验重复3次。细胞存活率=给予更昔洛韦细胞的吸光度/未给予更昔洛韦细胞的吸光度。　　1.2.4旁观者效应将转染了AdGHTK的GH3细胞和未经转染的GH3细胞分别以1∶4、2∶3、3∶2和4∶1的比例混合后，以4106/L的密度接种于96孔板中。培养1d后,其中一组加入浓度为10mg/L的更昔洛韦作为实验组，另一组加入等量PBS作为对照组，每隔2d添液一次。4d后检测细胞的存活率。细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）/细胞总数100%.　　1.3统计学处理　　应用SPSS16.0软件进行统计分析，

6、计量资料结果用x±s表示，数据间比较采用析因设计的方差分析及成组设计的方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。　　2结果　　　　2.1TK基因的表达　　AdGHTK转染组有两条明显的蛋白条带，相对分子质量分别为42000和46000;而对照组则仅有1条带，相对分子质量为42000（图1）。TK基因已转染入GH3细胞，并成功表达。【图1】　　2.2TK基因对更昔洛韦敏感性影响　　不同更昔洛韦浓度细胞存活率比较，差异有显着性（F=148160.215,P<0.001）;不同MOI浓度细胞存活率差异

7、亦有显着性（F=275838.795,P<0.001）;更昔洛韦浓度和MOI浓度间存在着显着的交互效应（F=14245.000,P<0.001）.当MOI浓度为0时,细胞存活率不随更昔洛韦浓度的变化而变化；当MOI浓度为1~500PUF/cell时,细胞存活率随更昔洛韦浓度的增加而降低；当MOI浓度为10PUF/cell时,更昔洛韦浓度为1mg/L就产生细胞毒性（细胞存活率明显下降）；当更昔洛韦浓度为10mg/L时，细胞产生完全毒性（细胞死亡率接近100%）.转染细胞存在明显的敏感性。在高浓度MOI（100、50

8、0PUF/cell）下，即使更昔洛韦剂量很低，也会产生明显的细胞毒性。见表1.【表1】　　2.3旁观者效应　　未转染组细胞存活率为（98.51±2.16）%,1∶4混合转染组为（51.32±2.34）%,2∶3混合转染组为（11.23±2.07）%