探究不同浓度南蛇藤素对人肺癌细胞的抑制作用

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1、探究不同浓度南蛇藤素对人肺癌细胞的抑制作用　　肺癌已成为危害生命健康的主要疾病之一，其发病率与死亡率逐年上升.2012年美国死于肺癌人数约16.0万，新增肺癌患者约22.6万.在我国城市中，肺癌死亡人数由原来的第4位上升为第1位，农村上升最快的死亡人数也是肺癌患者.调查显示在过去30年间，肺癌死亡率在我国上升了46.5%，肺癌已成为我国恶性肿瘤死亡主要原因之一.肺癌发生于支气管粘膜上皮，亦称支气管肺癌.肺癌一般指的是肺实质部的癌症，非小细胞肺癌则占肺癌总数的80%，其5年生存率仅为15%。　　　　近年来，大量的研究表明:天然植物中存在具有治疗价值的抗癌药物，天然植物

2、药物以其所特有的低毒、有效、无耐药性及整体调节等方面的优势，在肿瘤治疗中起着越来越重要的作用.雷公藤红素(Celastrol)，又名南蛇藤素，是从传统中药卫矛科植物雷公藤属(TripterygiumHook)及南蛇藤属(CelastrusL)，植物中分离出的活性较高的五环三萜类物质，具有抗炎、抗氧化等多种药理活性，是雷公藤片和雷公藤多甙片中的有效成分，广泛用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、肿瘤等有关疾病的治疗.近来多项研究表明，雷公藤红素可以抑制多种肿瘤细胞株生长，诱导其凋亡，同时，能够通过ＲOS介导的上调CHOP通路，下调促生存蛋白和上调促凋亡蛋白的表达增强TＲAIL

3、诱导的人类乳腺癌细胞凋亡.本研究通过不同浓度的雷公藤红素处理人肺癌细胞，检测药物对这两种细胞生长的抑制作用、细胞凋亡及其形态的影响，为肺癌的临床预防和治疗提供一定的理论依据。　　　　1材料与方法　　　　1.1材料　　　　1.1.1细胞株:人肺癌细胞(H727细胞、H1299细胞)购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。　　　　1.1.2试剂:ＲPMI－1640培养基，胎牛血清，双抗，磷酸缓冲生理盐水PBS，胰蛋白酶(均购于Gibco公司)，雷公藤红素(购于上海源叶生物有限公司，纯度≧98%).DMSO(二甲基亚砜，购于上海生工生物工程有限公司)，

4、DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，购于美国Ｒoche公司)。　　　　1.2方法　　　　1.2.1细胞培养　　　　H727、H1299细胞细胞株用含有10%的灭活胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、pH7.4的ＲPMI-1640完全培养液于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。　　　　1.2.2雷公藤红素的配制雷公藤红素用DMSO(二甲基亚砜)配成100mmol/L的母液，－80℃储存.使用前，用含10%胎牛血清的ＲPMI-1640培养液配成不同浓度的工作液，DMSO的终浓度不超

5、过0.1%。　　　　1.2.3MTT检测细胞活性实验取对数生长期的细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为5104个/mL，按每孔100μL接种于96孔板，放置于37℃、5%的CO2孵箱中过夜培养.待细胞贴壁生长后，加入不同浓度(0，0.25，0.5，1，2μmol/L)的雷公藤红素工作液.同时设置无细胞，只有ＲPMI-1640培养液为对照组，每组设8个平行孔.培养24和48h后，每孔再加MTT(5mg/mL)10μL，放置于37℃、5%的CO2孵箱中培养4h，向每孔加150μL的DMSO，震荡10min，用酶标仪在492nm处测定OD值.按下式计

6、算不同浓度的药品对细胞的生长活性的影响，细胞活性=(给药组平均OD值/对照组平均OD值)100%。　　　　1.2.4流式细胞仪测肿瘤细胞凋亡取对数生长期的细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为5105个/mL，接种细胞到6孔板内，放入37℃，5%的CO2培养箱培养过夜，待其长至80%无血清培养18h使细胞同步化.取出6孔板，放在超净工作台上，吸尽培养液，依次加入预先配制好的浓度分别为0、0.5、1μmol/L的雷公藤红素溶液2mL于准备处理的细胞中，培养24h后，收集细胞及其上清液，用凋亡试剂盒进行处理，并进行流式检测。　　　　1.2.5DAPI染色测肿瘤细胞形态

7、将对数期的H727和H1299细胞接种到6孔板内，细胞数目为1106/孔，放入37℃，5%的CO2培养箱培养过夜，待其长至80%无血清培养18h使细胞同步化.取出6孔板，分别加入浓度为0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L的雷公藤红素，放入37℃，5%的CO2培养箱培养处理24h.PBS清洗2遍，避光加入DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色液0.5ml，室温避光孵育5－10min，PBS清洗4－5遍，用荧光显微镜观察。　　　　2结果分析　　　　2.1不同浓度的雷公藤红素对H727细胞、H1299细胞活性的影响