apob基因多态性研究的意义

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1、1.材料和方法1.1材料EcoRI、PCR扩增引物序列均参照GajraB等[1]，MspI位点的PCR扩增引物序列参照SoriaLF[2]，3'VNTR的PCR扩增引物序列参照罗超权等[3]，引物的序列如下（由上海铂尚生物技术公司合成）：EcoRI5’primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG3’primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCACMspI5’primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG3’primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC3'VNTR5’primer：CTG

2、AGAGAAGTGTCTTCGAAG3’primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC模板DNA:健康人口腔黏膜上皮细胞16份(来源随机抽取健康...)PCRMIX（Taq1.25U,dNTP各0.4mM,2×PCRBuffer）EcoRI酶切体系（10µlPCR产物、18µl双蒸水、2µlEcoRI酶切Buffer、1µlEcoRI限制内切酶（10U/µl））MspI酶切体系（10µlPCR产物、18µl双蒸水、2µlMspI酶切Buffer、1µlMspI限制内切酶（10U/µl））dNTP、抽提缓冲液（100m

3、MTris，50mMEDTA，200mMNaCl，0.5%SDS，200ug/ml蛋白酶K，pH8.0)、酚：氯仿(1：1)、氯仿：异戊醇(24：1)、乙醇、70%乙醇、TE缓冲液仪器：凝胶成像系统、BG-Power300电泳仪、ZD-600标准水箱、小型台式告诉冷冻离心机、Hema3200基因扩增仪、0826微型离心机1.2方法1.2.1口腔粘膜上皮细胞基因组DNA的提取将生理盐水漱口液10ml转移至15ml离心管，8000rpm离心10min。倒出上清，管内白色沉淀即为口腔粘膜上皮细胞。用酚/氯仿提取法从外周白细胞提取基因

4、组DNA：将口腔粘膜上皮细胞细胞重悬于0.5ml抽提缓冲液,65℃水浴30分钟,依次加入等体积的酚：氯仿(1：1)和氯仿：异戊醇(24：1),分别抽提1次。DNA用乙醇洗淀并经70%乙醇洗涤后室温干燥,加入适量TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。1.2.2PCR扩增PCR扩增反应体系如上，扩增程序分别如下：EcoRI：94℃预变性7min；94℃变性1min,58℃复性与延伸3min,进行30个循环；最后72℃再延伸5min。MspI：94℃预变性7min；94℃变性1min,60℃复性1min,72℃延伸1min，进行30个循

5、环；最后72℃再延伸5min。3'VNTR：94℃预变性7min，94℃变性1min，60℃退火及延伸共4min，进行30个循环，最后60℃再延伸10min。1.2.3基因多态性的检测与分型EcoRI酶切位点：通过PCR-RFLP技术检测，先建立31µl酶切体系，混匀后37℃酶切12小时，65℃加热20min终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，凝胶成像仪拍照电泳结果。MspI酶切位点：通过PCR-RFLP技术检测，先建立31µl酶切体系，混匀后37℃酶切12小时，80℃加热20min终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产

6、物，凝胶成像仪拍照电泳结果。3'VNTR：PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪拍照电泳结果，然后通过软件计算PCR产物的分子量。apoB3'VNTR序列由两端152个保守序列和中间以15bp核心序列多次重复组成，核心序列重复次数由以下公式估算获得：（扩增片段bp数—152bp）/15bp。2.结果2.1apoB3’VNTR多态性16个样本DNA经扩增后均出现1-2条带（纯合子为1条带，杂合子为2条带），其中11个样本为杂合子，5个样本为纯合子。共检出片段大小不同的21条带（如图1）。以15bp为一重复单位，重复次数为

7、31-57次。其中以35-36次较多，占40.7%（见图2）。而38次以上和32次以下出现频率较低。图1.apoB基因VNTR电泳图图2.apoB基因VNTR重复次数频数分布表2.2酶切位点多态性2.2.1EcoRI酶切位点多态性apoBPCR产物酶切后可见两种基因型：12个样本有253bp、227bp两条碱基片段，是E+E+型纯合子；4个样本有480bp、253bp、227bp三条碱基片段，是E+E-型杂合子；未见有480bp一条碱基片段的E-E-纯合子。（见图3）图3.apoB基因EcoRI酶切电泳图注：2、5、8、10、

8、11、12、13、16、17、18、20、21泳道为E+E+型，3、4、9、19泳道为E+E-型，6、14、22泳道为PCR产物未酶切的对照。2.2.2MspI酶切位点多态性apoBPCR产物酶切后可见两种基因型：12个样本有395bp、85bp两条碱基片段，是M+M+型纯合