青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum) 绿色荧光蛋白标记研究

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1、11期车建美等：含绿色荧光蛋白标记的青枯雷尔氏菌确良（Ralstoniasolanacearum）青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）绿色荧光蛋白标记研究车建美1,2，蓝江林1，刘波1（1福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州350003；2福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州350002）摘要：【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记，研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化，采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条

2、件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同，均为长椭圆形，近杆状，整个细胞呈现绿色荧光，PCR结果表明，从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期，荧光素酶活性快速增加，到稳定期，荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次，仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致，在番茄组培苗内的侵染路线相同，致病力均达到90%以上。【结论】利用gfp和luxAB融合

3、基因成功转入青枯雷尔氏菌，融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。关键词：青枯雷尔氏菌；电击法；gfp/luxAB基因GFPTaggingRalstoniasolanacearumwithgfp/luxABmini-Tn5CHEJian-mei1,2,LANJiang-lin1,LIUBo1(1AgriculturalBioresourceResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003;2KeyLaboratoryofBiopesticideand

4、ChemicalBiology,FujianAgricultrueandForestryUniversity,MinistryofEducation,Fuzhou350002)Abstract:【Objective】TheRalstoniasolanacearumstrainwaschromosomallytaggedwiththemarkergenesgfpandluxABbyelectroporation.Thegrowthpropertiesandthepathogenicityofthetaggedstrainandthewildtypestrainwerecompar

5、edinthispaper.【Method】TheR.solanacearumstrainwastransformedbytheelectroporation.TheconditionandprocessoroftheinvasionoftheGFP-taggedstrainwasobservedinthetomatotissuecultureplants.【Result】Transformantwasscreenedforthegreenfluorescencebyfluorescencestereomicroscopy.A3.0kbfragmentofthegfpgenea

6、ndluxABgenewasamplifiedfromthegenomeDNAoftheGFP-taggedstrains.Morphologically,thecellsoftheengineeredstrainweresimilartowildtypestrainasdeterminedbylaserscanningconfocalmicroscopy.LuciferaseactivityoftheGFP-taggedstrainincreasedrapidlyduringthelogphase,butdecreasedinthestationaryphase.Thegre

7、enfluorescencecouldbekeptuntil20timesofsubcultures.ItwasthesamefortheGFP-taggedstrianandthewildtypestrainintheculturetemperature,pHvalueandgrowthcurve.TheseresultsconfirmedthatthedualmarkerwasinsertedsuccessfullyintotheR.solanacearumstrain.Thepatho