间接elisa法测定大肠杆菌dh5α菌体蛋白含量的实验研究

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1、间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究免疫学杂志1999年第4期第15卷技术与方法作者：邓瑞春白云秀张明伟汪劲松黄英毛宁单位：军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所北京100850关键词：酶联免疫吸附测定粒细胞巨噬细胞集落刺激因子大肠杆菌　　摘要采用大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清，建立了间接ELISA方法经初步测定，该方法的灵敏度0．5ng／ml，比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色方法的灵敏度高3000倍，比银染色方法的灵敏度高150倍。在20～620ng／ml范围内测定呈直线关系，直线相关系为0.895。经8次重复测定，

2、显示很好的重复性。可用于测定rhGM-CSF等基因工程产品中DH5α菌体蛋白的残余量。　　中图号R371-34　　DETERMINATIONOFTHEE．COLIDH5αPROTEINREMAINSIN　　GENICENGINEERINGSEMI-FINISHEDPRODUCTGM-CSFDengRuichun，BaiYunxiu，ZhangMingwei，WangJinsong，HuangYing，MaoNing　　（ReadFour-RingInstituteofBiotechnology，AcademyofMilitaryMedicalScienc

3、es，Beijing100850）　　AbstractTheantiserumwerepreparedagainstthetotalDH5αproteinbyimmunizingrabbits，andthenamethodwasestablishedtodeterminetheremnantsE．coliDH5αproteininthegeneengineeringsemi-finishedpro-ductofrhGM-CSF．Thesensitivityisabout0．5ng／ml，3000timeshigherthanthatofCoomasieB

4、riliantBluestai-ningand150timesthanthatofsilverstainingofPAGE．Thelinearrangeofthemethodisbetween20-620ng／mlandthecorrelationcoefficient（r）is0．985，andrepeativityisgood．　　KeywordsEnzyme-likedimmunosorbentassay（ELISA），Recombinehumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor（rhGM

5、-CSF），Escherichiacoli（E．coli）　　大肠杆菌DH5α是目原核细胞表达系统中，应用最普遍的基因工程菌之。人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、人重组白细胞介素-2（rhIL-2）、人重组干扰素-α（rhIFN-α）等外源基因，都是在该宿主菌中获得高效转录和表达的。随着对基因工程产品在临床上的大量应用，对产品中宿主蛋白残余量的要求越来越严格。目前常用来鉴定残余蛋白的方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），毛细管电泳（CE），等电聚焦（IEF），HPLC（包括凝胶过滤，各种反相HPLC，离子色谱，疏水色谱等）。

6、此外，还有一些化学法如观察末端是否均一等等。本文建立了间接ELISA方法，它简便、快速、灵敏、经济，是一种非常值得推广的方法。　　1材料和方法　　1.1材料　　大肠杆菌DH5α菌体蛋白，由本室培养制备；HRP-羊抗兔IgG，购自本院微生物流行病学研究所；Western印迹试剂盒，购自Sigma公司；卡介苗，购自北京生物制品所。BDSLImmunoskan340型酶联仪，英国；电泳仪，购自北京六一仪器厂。　　1.2方法　　1.2.1大肠杆菌DH5α培养及菌体蛋白的测定［3，4］：于LB培养基中培养大肠杆菌DH5α，经离心收集菌体，生理盐水洗2次，超声破碎，

7、离心15000r／min10min，收集上清菌体蛋白，紫外分光光度法测定蛋白光吸收值，通过公式：mg／ml蛋白＝1．45×OD280－0．74×OD260计算含量，SDS-PAGE对DH5α菌体蛋白成分进行分析。　　1．2.2大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫：于免疫前1周，兔两侧腹股沟淋巴结注射卡介苗0．7mg，取4mg大肠杆菌DH5α菌体蛋白与1ml福氏完全佐剂混合，制成乳剂，于背部皮下多点免疫；2周后，注射不完全佐剂，免疫原剂量同前。随后，每隔2周加强1次，连续注射3次，最后1次自腹腔注射9mg抗原蛋白。7d后放血，收集血清，分装，于－20°C保存。　　

8、1.2.3抗体效价测定：按文献［1］琼脂糖免疫双相扩散法。制备1％琼脂糖胶，铺板