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1、真菌的固体发酵工艺研究真菌是最早被发现引起昆虫疾病的微生物，原因是它们可长出寄主体表，明显可见。虫生真菌多从体壁侵入，自然扩散力强，对于防治刺吸口、钻蛀性以及在地下生活的害虫具有无可比拟的前景，再加上大多容易人工培养，这些优良性状使其应用始终引人注目。目前,化学农药(如DBCP、呋喃丹等)仍是我国生产量最大、应用最广的杀虫剂。20世纪60年代曾在山东建厂生产农药DBCP(二溴氯丙烷)来杀线虫,DBCP的生产使工人患男性不育症而停止生产,后来又曾一度从国外进口呋喃丹,呋喃丹因有毒已被禁用。化学农药的生产和使用会造成农产品农药残留和自
2、然环境污染,因此,开发对环境友好的生物菌剂势在必行,也必将成为未来的主导品种。我国是农业大国,植物线虫病害愈来愈受到我国政府、企业和农户的重视,真菌剂是一种具有广阔应用前景的生物防治剂。金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）是首先被研制成杀虫剂的微生物。目前世界上已记载的虫生真菌约有100属，800种以上。近20年来，真菌杀虫剂研究进展很快，迄今先后有50多种产品注册。真菌在生物防治上虽然表现出巨大的潜力,市场前景广阔,但大规模生产技术的不成熟是限制其工业化的主要因素之一[11],本文利用真菌二级液体发酵,培养
3、真菌液体菌种,再转接到固体培养基上,进行固体发酵。真菌固体发酵工业化生产中试,以实验室真菌剂发酵成功数据为基础[12～16],进行优化固体发酵工艺,为工业化规模生产奠定了坚实的基础。1真菌固体发酵一般工艺流程1上罐后第一天清洗固体发酵设备，准备好一切用品；2转固体发酵前一天开水浸泡大米一小时后用蒸饭车常压灭菌2小时（可同时结合50L高压蒸汽灭菌锅一起灭；同时对拌种场及设备进行进行消毒。3转固体当天再用蒸饭车常压灭菌一次(早晨进行，以保证傍晚之前上盘)；同时对拌种场所同风，准备无菌水。4以上步骤在发酵室进行，液体种子工程中心发酵后，
4、桶装带至发酵室。5期间通过空调调节室温，调节培养料温度；加湿器调节湿度（前三天保持95%-100%，之后控制在70-80%以利于产孢）。2真菌剂生产培养基及仪器和生产设备1生产原料大米：250kg（以2%的产孢量估计）；植物油：2.5L（1%）；麸皮；豆饼粉2生产设备20L种子罐；发酵包；蒸饭车；50L高压蒸汽灭菌锅；拌种容器（鼎）；加湿器（或保鲜膜覆盖取代加湿器）;温度计；湿度计；无菌手套；一次性口罩。3真菌固体发酵3.1 真菌液体菌种培养目前国内真菌生物农药工业生产的菌种扩大培养一般都采用实验室和生产车间二级种子培养流程。斜面
5、菌种的培养是工业发酵工艺中的关键环节，操作必须在无菌室严格进行无菌操作。每次使用无菌室前后须打扫干净并进行紫外或臭氧灭菌。斜面菌种在一般在25℃左右的培养箱中培养4～14天，具体依菌种而定。斜面菌种不宜传代过多，一般不超过三代，以防菌种退化。有时也可使用平板培养基进行菌种培养。其表面积大，产孢多，菌落生长和杂菌污染易观察，但无菌操作不如斜面培养基方便。将固体培养基上培养出的孢子及菌丝转入三角瓶液体培养基中培养，通过往复振荡或旋转振荡增加通气，使菌体大量增殖的过程。注意因菌种的不同而调节温度、培养基的组成和初始pH值、培养时间以及摇
6、床的速度。SDY或SD是常用的培养基。也可使用天然材料自行设计并经试验确定适于摇瓶培养和下一步种子罐培养的液体培养基。种子罐的大小和需要逐级扩大培养的次数根据固体培养物的量而定。例如，2500kg的固体培养基，按照14%的接种量计，需要350L液体种子，因此需要一套5L-50L-500L的三级种子罐系统。种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由多次移种而造成的杂菌污染机会。发酵过程中应注意观察，并将温度、pH值和溶氧等发酵参数控制在有利于菌丝生长的最佳范围。另外还要通过在培养基中加入各种植物油及其他化学消泡剂（如聚二醇、
7、十八醇等高级醇类，聚氧丙烯甘油等聚醚类）或通过罐内的机械消泡装置来控制发酵过程中产生的泡沫，以防止泡沫“顶罐”而造成培养液逸出和杂菌污染。真菌农药使用的都是好气性真菌，它们在深层液体中培养只能利用溶解在水中的氧，因此如何保证发酵液中有较高的溶氧浓度（mg/L）是发酵成功的重要保证。溶氧浓度是由通气量控制的，而通气量是由来自空压机的高压气流（气升式发酵罐）的速率或搅拌转速（搅拌式发酵罐）决定的。在真菌发酵常用的温度24℃下，必须保证溶氧浓度不低于0.02mol/m3,菌丝的呼吸才不会受到抑制。3.2 真菌固体发酵间处理保证真菌菌种生
8、长的环境无其它杂菌,因此,在生产前对固体发酵间及准备间进行彻底灭菌,即甲醛薰蒸彻底灭菌。3.3 真菌固体发酵时用具及物品的消毒为保证给真菌固体培养基接种时无杂菌侵入,真菌固体发酵过程用的铁钯子、量杯、纱布、无菌服、口罩、手套等用具及用品用牛皮纸包好
