单核巨噬细胞(RAW264.7)复苏与培养、消化与冻存.docx

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1、单核巨噬细胞（RAW264.7）复苏与培养、消化与冻存1材料与方法1.1实验材料1.1.1细胞及中药单体成分：小鼠RAW264.7单核巨噬细胞株购自上海细胞库；LPS购于sigma公司；1.1.2主要试剂RPMI-1640培养液：Gbico公司产品胎牛血清：Gbico公司产品DMSO(批号DZ0231)：AMRESCO公司产品胰蛋白酶：Merck公司产品青霉素-链霉素：Gbico公司MTT、台盼蓝试剂：Sigma公司产品PBS：上海双螺旋生物科技有限公司TNF-αELISA试剂盒：美国eBioscience公司1.1.3仪器CO2培养箱：美国ThermoFroma公司酶标仪：Biora

2、d公司倒置显微镜：日本olympus公司高速低温冷冻离心机：德国Eppendorf公司侧摆摇床：欧瑞实验器材公司培养瓶/培养皿、24孔/48孔/96孔培养板、离心管：美国BD公司1.2实验方法1.2.1单核巨噬细胞（RAW264.7）复苏与培养：实验操作前，先将水浴锅预先调至37℃，无血清的RPMI-1640培养液于37℃水浴锅内预热，15ml的离心管4℃热平衡；用镊子将单核巨噬细胞（RAW264.7）的细胞冻存管从液氮罐中取出，浸入含37℃水的烧杯内，轻轻晃动冻存管，冻存管内冰核差不多融化时取出冻存管移至超净工作台内，用酒精棉球擦拭管口；在15ml离心管内加入4ml含10%FBS及1

3、%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液，再将冻存管内含细胞的悬液吸至该离心管内，盖上管盖，轻轻摇匀和上下颠倒混匀；继续添加含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液至离心管刻度14ml处，盖上管盖，轻轻颠倒混匀；离心机设置4℃，1000rpm，离心5min后，小心吸出上清液，然后轻弹离心管底部使细胞团分散，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液14ml，盖上管盖，轻轻颠倒混匀，4℃，1000rpm离心5min，弃上清液，加2ml无血清的RPMI-1640培养液混匀，取50μl细胞悬液使用台盼蓝试剂进行活细胞计数；加细胞培养液稀释至所需

4、的细胞浓度，移至培养瓶内培养内置于含5%CO2培养箱（37℃）中，1-2d更换细胞培养液1次，呈贴壁生长，2-3d用0.25%胰酶消化传代1次。1.2.2单核巨噬细胞（RAW264.7）消化与冻存单核巨噬细胞（RAW264.7）消化:实验操作前，先将水浴箱预先调至37℃，将0.25%胰酶及含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液置于37℃水浴箱中水浴备用，将长满单核巨噬细胞（RAW264.7）的培养瓶中原培养液弃去，用PBS洗涤3次，再加入1-2ml0.25%胰酶，使瓶底细胞都浸入胰酶溶液中，于含5%CO2的37℃培养箱中消化3min；在倒置显微镜下观察细胞，原贴

5、壁细胞逐渐趋于圆形时，加入10ml含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液终止消化；轻轻敲打培养瓶并用吸管将贴壁细胞吹打成悬液，分别转移至15ml离心管中，盖上管盖，轻轻颠倒混匀，4℃，1000rpm离心5min，弃上清液，加4ml含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液混匀，取50μl细胞悬液进行细胞计数，再加适应量的含10%FBS及1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液稀释至细胞密度为1x106个/ml；再移至培养瓶或24孔板内培养内置于培养箱（5%CO2，37℃）中培养。单核巨噬细胞（RAW264.7）冻存：将备好的细胞冻存管做好

6、标记（RAW264.7、日期、实验室单位），配置好一定量的细胞冻存液，配置比例为RPMI-1640培养液：血清：DMSO=7：2：1；将已经消化下来的细胞悬液4℃，1000rpm离心5min，弃上清液，留下细胞，缓慢加入已经配好的细胞冻存液，轻轻混匀；每个细胞冻存管中加入含冻存液的细胞悬液1.8ml，盖上瓶盖，置于梯度降温盒内，再分别放在4℃冰箱内30min、-20℃冰箱内2h和-80℃冰箱内过夜；第二天放于液氮罐内并且做好标记和登记工作（存放单位、存放时间、存放管数）。