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时间:2018-10-29
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1、细胞冻存、解冻方法与细胞计数问:复苏的肿瘤细胞传代多久后,弃之不用并解冻新的细胞?在传代的过程中,有时细胞长得太满,都开始死亡了才传,对细胞有什么不良的影响,有没有固定的传代间隔时间?答:rumex认为培养的代数因细胞不同而不同,肿瘤细胞培养两个月应该不会有问题,但培养的不好就另说了,细胞数量达饱和密度后,细胞遂停止增殖,进入停滞期。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,继而培养液中营养渐趋耗尽,代谢产物积累、pH降低。要及时做分离培养即传代,否则细胞会中毒,发生形态改变,重则从底物脱落死亡,故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象)能影响下一
2、代细胞的机能状态。在这种情况下,虽进行了传代,因细胞已受损,需要恢复,至少还要再传1~2两代,通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后,才能再用。否则影响实验结果,而且我们连续两次培养太密的细胞就不要了。传代时间要你自己掌握哦,因为不同细胞的倍增时间可能不同,你接种的密度也可能不同,所以什么时候传代你也可以自己估计啊,开始培养细胞时,每天计数,估计倍增时间,计算以你接种的密度多久到对数生长期,一般保持在对数期内传代,一周两次差不多了。liuzeyi2002认为要根据细胞的代谢情况和接种密度,把握传代间隔时间。我们养的是肺癌细胞,A54
3、9就代谢很快,如果是1比5稀释传代的,也要3天就传一次代,还有的细胞因为恶性度较高,贴壁不好,需要两天传一次。3、材料:37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤:(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入
4、无菌操作台内。(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1
5、、原理:(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈
6、色。一般使用蓝色之trypanblue染料,如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。2、材料:0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061);Erythosinbluishstain;取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05gr
7、ampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。3、步骤:(1)取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数
8、盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。(3)计数四个大方格
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