细胞冻存与复苏　

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1、细胞冻存与复苏细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。细胞的冻存【用品】（1）  5%胰蛋白酶（2）  含10%~20%血清培养液（3）  DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）  吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）  从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。（2）  用胰蛋白酶

2、把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。（3）  去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。（4）  装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液

3、氮时，要带手套操作以免冻伤。细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。细胞的复苏【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】（1）  从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。因此，存取冻存管

4、时都要佩戴眼镜和手套。（2）  从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。（3）  用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。细胞复苏时细胞数可以做10~20倍稀释，接种密度以5×105/ml为宜。　　　1冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并

5、注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。2细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。3可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养

6、条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5何谓FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calfseru

7、m)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。6培养细胞时应使用5%或10%CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。7何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。8培养基中是

8、否须添加抗生素？　除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。9附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。10悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍