细胞冻存与复苏 步骤.doc

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1、细胞冻存一、实验用品:二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液(培养液+保护剂):DMEM培养基:胎牛血清:DMSO=7:2:1,配成1ml2、过程(1)对数生长期细胞,弃去旧培养液;(2)PBS洗清2-3次细胞(3)0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞,制成细胞悬液,1000r/min离心5min,弃上清液;(4)加入冻存液,轻轻吹吸均匀(5)按每管1.0ml的量,分装入冻存管,拧紧管盖;(6)在冻存管上做标记,包括细胞代号及冻存日期;(7)分级冷冻

2、:4℃冰箱内30-40min,转入-20℃冰箱60min,放入-80℃冰箱,将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管,胎牛血清,DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作:(1)将恒温水浴箱中的水温调至37℃(2)离心管、培养瓶,瓶口均过火(3)尖吸管,过火处理后插入无菌试管中(4)配培养液,放入超净台,瓶口过火,盖拧松,待用。2、复苏和培养:迅速取出冻存管(1)大镊子夹其盖部,在37℃温水中快速摇动,待有残留小冰核时,快速用含有消毒水的纱布擦拭,放入超净台(2)冻存管迅速过火开盖,手持无菌尖

3、吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来,转移至刻度离心管中,用过的尖吸管插回原试管中(3)培养瓶盖子打开过火,用另一尖吸管往离心管中加入培养液,拧上盖子,过火(4)1000r/min离心5min(5)离心管管口过火,拧开,过火,液体倒入废液缸,再过火,加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液,轻轻吹打离心管底部的细胞,随后将其转移至培养瓶中(6)观察细胞状态,放入5%CO2培养箱中培养(7)(1)(2)

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