细胞冻存与复苏

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1、细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存方法预先配制冻存液：20%血清培养基10%DMSO（二甲基亚砜）取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹

2、打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。慢冻程序标准程序（放哪里？）当温度在-25℃以上时，1-2℃/min当温度达-25℃以下时，5-10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃）细胞复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏

3、的细胞低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。注意事项：在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩

4、、工作衣或防冻鞋。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196℃的液氮中取出冻存管，立即投入37℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质和细胞（非同一种的其他细胞）。微生物污染的途径空气：

5、微生物传播的最主要途径。器材：清洗消毒不彻底。操作：无菌观念不强，操作不规范。血清：支原体或病毒污染。组织样本：造成原代培养污染。微生物污染对细胞的影响体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力；培养基中加入的抗生素的抗污染能力有限；培养细胞一旦发生污染，多数将无法挽救；污染早期或污染程度较轻时，及时处理，部分细胞有可能恢复。污染物持续存在对细胞的影响：轻者细胞生长缓慢，分裂相对减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞质中出现较多的颗粒状物质；重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量的堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。微生物污染的检测真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，

6、尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孢子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌等。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了

7、抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除干净，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件