最新专题课题多聚酶链式反应扩增DNA片段教学讲义PPT课件.ppt

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1、专题课题多聚酶链式反应扩增DNA片段核心要点突破知能过关演练课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段基础自主梳理基础自主梳理一、PCR扩增的原理及条件1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2．原理(1)DNA的热变性：在80～100℃的温度范围内，DNA_________结构解体，双链分开，这个过程称为_____。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。多聚酶链式反应DNA双螺旋变性思考感悟2

2、．PCR循环过程中，变性温度设置95℃，时间设置30s的原因是什么？【提示】变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。三、实验操作1．实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控_____，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个___________代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行离心的场所。(3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每

3、吸取一种试剂后都要更换。温度恒温水浴锅2．操作步骤准备→____→混合→_____→反应。四、操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。2．所用的_________和酶应分装成小份，并在－20℃储存。五、DNA含量的测定1．原理：利用DNA在260nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。2．计算公式：DNA含量(μg)＝50×(260nm的读数)×_____________。移液离心高压灭菌缓冲液吸收稀释倍数核心要点突破要点一PCR原理1．PCR扩增方向：

4、为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。2．PCR原理——DNA的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。3．生物体内DNA复制与PCR反应的区别体内复制PCR反应解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分

5、子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行(2011年聊城高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是()A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B．DNA复制不需要引物C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

6、D．PCR扩增的对象是氨基酸序列【尝试解答】__C__例1【解析】由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。【探规寻律】(1)引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。(2)细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。跟踪训

7、练(2011年海淀区高二检测)关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是()A．加入的TaqDNA聚合酶耐高温B．不同大小DNA在电场中迁移速率不同C．此过程需要DNA连接酶D．扩增区域由两种引物来决定解析：选C。PCR扩增实验是在较高温度下进行的，故需要耐高温的TaqDNA聚合酶，但不需要DNA连接酶，A项正确，C项错误。因为不同大小的DNA带有不同数量的电荷，所以在电场中迁移速率不同，B项正确。PCR扩增需要两种引物，分别与DNA的两条模板链互补，则D项正确。要点二PCR反应的实验操作过程1．反应体系的配方10倍浓

8、缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL注：①总体积50μL，②模板DNA的用量在1pg～1mg之间2.实验用具(1)PC