课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

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1、专题五DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA技术知识回顾DNA分子的结构C、H、O、N、P1、组成元素脱氧核苷酸2、基本单位3、脱氧核苷酸结构复习DNA复制的条件解旋酶：打开DNA双链DNA母链：提供DNA复制模板4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链引物：使DNA连接脱氧核苷酸ATP1、DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端-OH端为3′磷酸基团的末端为5′。DNA的双螺旋结构是如何形成的2、复制过程解读①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋

2、链解旋为两条平行的双链②RNA引物的合成,以单链DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成冈崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断⑤DNA片断的连接在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的子代DNA1、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物2、DNA

3、聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸想一想思考：能否在体外模拟体内DNA复制条件，进行DNA扩增？PCR技术1、PCR（多聚酶链式反应）技术：2、原理：一、基础知识（一）PCR原理：阅读课本P58-59DNA母链：解旋酶(条件）：4种脱氧核苷酸：DNA聚合酶（条件）：ATP：引物：缓冲溶液适宜温度3、PCR反应的条件80—100℃：耐热的DNA聚合酶：(二)PCR反应的过程1、变性：温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。2、

4、复性（退火）：温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3、延伸：温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。PCR循环第一步：加热变性:双链DNA解聚成为单链模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸:合成新的DNA链模板序列模板序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环

5、次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,82430次循环后扩增的数量4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ（延伸而成的DNA单链）结合，进行DNA的延伸。PCR反应详细解析第一轮变性ＡＢ复性ＡＢ延伸ＡＢ第二轮Ａ变性Ａ1Ａ2A链PCR复性Ａ1Ａ2延伸Ａ1Ａ2PCR终产物B链PCR变性BB1B2复性B1B2PCR终产物延伸B1B2第三轮A1B2同A链

6、第二轮PCR反应同B链第二轮PCR反应试验设计利用PCR技术扩增双歧杆菌的DNA的片段实验器材双歧杆菌培养基离心机微量移液器化学试剂PCR仪1.双歧杆菌的培养培养24h培养基配方：大豆蛋白胨5g酵母提取物10g微量盐溶液40ml葡萄糖10g半膀氨酸盐酸盐0.5g0.1%胰胨5g刃天青1mlPH=7实验过程2.PCR操作菌液离心，保留底部双歧杆菌沉淀在双歧杆菌沉淀中加入0.2ml裂解液，使细胞裂解，释放DNA3.DNA处理2.提取DNA55℃加热孵育3h90℃加热10min冷冰中冷却离心1.菌体处理4.其它组分添加DNA上清液10μL10倍扩增缓冲

7、液5μL25mmol/LMgCl2溶液3μL20mmol/L4种脱氧核苷酸的均匀混合液1μLTaq聚合酶1μL两种引物各0.5μL蒸馏水29μL预变性94℃，5min30次重复反应94℃，30s55℃，30s最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min72℃，1min5.PCR反应变性复性延伸6.PCR产物检验分光光度计法取2μLPCRDNA溶液，加入98μLH2O，使DNA５０倍稀释以蒸馏水为对照，在260nm处测样品DNA的光吸收值根据公式计算DNA含量DNA含量（μg/mL）=50×（260nm度数）×稀释倍数结果分析与评价根据公

8、式计算DNA片段的含量比扩增前增加了了多少倍。相关链接琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量1.配制浓度为１％的琼脂糖凝胶，倒入电泳槽中，插好梳