课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段 (2).ppt

《课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段 (2).ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就由可能为案件的侦破提供证据。讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？2.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术1993年诺贝尔奖DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端识别：-OH端为3′;磷酸基团的末端为

2、5′。参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：细胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链的原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸思考：体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？变性（80～100℃）TaqDNA聚合酶（耐高温）20～30个核苷酸构成DNA或RNAPCR（多聚酶链式反应）（一）PCR原理DNA双链变性（加热80-

3、100℃）复性（缓慢冷却）DNA单链变性的目的：解开双链复性的目的：有利于引物1和引物2与两条单链的结合PCR扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1～3步30轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸变性→复性（退火）→延伸（二）PCR的反应过程：二、PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次

4、复制第一次复制555555模板DNA5555555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。三、PCR实验操作1、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够自动调控温度的仪器4、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（

5、4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步骤：四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算50倍蒸馏水做对照波长260nm处读数（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的

6、紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关光吸收波长／nm2602402202800.10.22、过程①稀释2µLPCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③测定并计算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA的含量为50g/mL紫外分光光度计比色杯体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解

7、开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸子链的5’端向3’端延伸靶序列靶序列PCR循环第一步：高温变性靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’Taq