[整理]基因工程操作步骤教学讲义ppt.ppt

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1、基因工程操作步骤知识回顾：基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作

2、用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子基因组DNA文库与cDNA文库的比较小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部

3、分基因可以③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA

4、模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ③过程：PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n

5、)形式扩增PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成_______b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Ta

6、q酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链3.人工合成法在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？人工合成法（真核生物）反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全

7、部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因二、基因表达载体的构建——核心（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用___________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了

8、一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏