基因工程的操作步骤.ppt

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1、1.2基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.基因的结构2.目的基因的概念3.目的基因的获取的方法1.基因的结构（1）原核生物基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游编码蛋白质调控遗传信息的表达（调控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…启动子终止子编码区非编码区非编码区启动子终止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGU

2、UA启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）启动子终止子（2）真核与原核生物基因结构的比较外显子内含子编码蛋白质（不能编码蛋白质）①相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。②不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。真核生物基因

3、结构外显子：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。内含子：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。2.目的基因的概念主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优良品质相关的基因，药物和保健品相关的基因，与毒物降解相关的基因，以及与工业所需要酶相关的基因。目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。3.目的基因的获取的方法（3）用化学方法直接人工合成目的基因（1）从基因库中获取目的

4、基因（2）应用PCR技术扩增目的基因（1）从基因库中获取目的基因①基因文库和部分基因文库的慨念②基因组文库和cDNA文库的主要区别③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因①基因文库和部分基因文库的慨念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库。基因组文库的建立方法提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA

5、片段与运载体连接导入受体菌中储存（基因组文库）目的基因分离部分基因文库的建立方法mRNA反转录酶单链DNA合成双链DNA（cDNA）载体插入导入受体菌群（cDNA文库）分离目的基因cDNA合成过程第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。9/15/202113②基因组文库和cDNA文库的主要区别文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基

6、因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）基因多少物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。（2）应用PCR技术扩增目的基因①定义：②原理：DNA复制PCR是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因DNA分子热变性（在90～9

7、5OC时，解旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之在处)③仪器：PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）④条件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，脱氧核苷酸，酶等。④过程：a.DNA热变性（90～95OC)：b.复性或退火（55～60OC)：c.延伸（70～75OC)：d.重复a.b.c步骤：双链DNA模板在热的作用下，氢键断裂形成单键DNA系统温度降低，引物结合到互补DNA链上，形成局部的双链DNA在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链DNA每重复一次，目的基因增加一倍PCR扩增为

8、指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因