猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体在体内抗病毒感染的初步验证.docx

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1、猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体在体内抗病毒感染的初步验证猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以怀孕母猪流产和不同年龄段猪的呼吸道疾病为临床特征的病毒性传染病。PRRSV具有逃逸宿主体液免疫应答机制等特征,导致现阶段商品化的疫苗不能给猪群提供完全的保护作用,且目前尚未得知有效的治疗方法,该病给我国养猪业带来巨大的经济损失。前期研究中,本实验室将PRRSV非结构蛋白Nsp9特异性纳米抗体Nb6基因通过（G₄S）₃Linker与细胞穿膜肽TAT基因融合,克隆至pET21b载体,成功构建pET21b

2、-TAT-Nb6表达载体。原核表达获得的TAT-Nb6重组蛋白具有与Nsp9重组蛋白相互作用的活性,并且能够进入MARC-145细胞和原代细胞PAM中,可以抑制多株PRRSV毒株（包括基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332））在以上两种细胞中的复制（Wangetal.2019）。因此,TAT-Nb6具有开发为新型抗PRRSV纳米抗体药物的潜力。基于以上背景,本研究通过对TAT-Nb6诱导表达温度、IPTG添加量和诱导表达时间的摸索,确定最佳的诱导表达条件,从而制备大量TAT-Nb6重组蛋白,对其在猪体内抗PRRSV作用进行验证,为抗PRRSV

3、纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。主要研究内容及结果如下:1.TAT-Nb6重组蛋白优化表达条件:为了获得TAT-Nb6在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中最大表达量,我们将含有pET-21b-TAT-Nb6表达载体的大肠杆菌在不同条件下进行培养,如不同的诱导温度、诱导剂浓度和时间。通过SDS-PAGE和westernblot分析。结果显示,TAT-Nb6重组蛋白在IPTG终浓度0.2mM,37℃诱导6h条件下诱导表达量最高。2.TAT-Nb6重组蛋白大量制备:TAT-Nb6重组蛋白在0.2mMIPTG,37℃,6h诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化、尿素梯度透析法复性和超滤管

4、浓缩,成功制备TAT-Nb6重组蛋白共350mg（6.25mg/ml）。ELISA结果显示,TAT-Nb6与Nsp9蛋白有很强的的结合力;免疫组织化学结果显示,TAT-Nb6可以进入所有检测组织。3.TAT-Nb6重组蛋白在猪体内抗PRRSV病毒功能验证:本实验通过人工感染28-35日龄无特定病原体仔猪PRRSVJXA1毒株(10^4.5TCID₅₀)后,注射TAT-Nb6重组蛋白,检测不同天数仔猪体温、抗体和病毒血症的变化情况。结果显示,治疗组的体温和PRRSV抗体水平明显低于攻毒对照组,而血清中病毒含量无明显差异。TAT-Nb6在猪体内的抗

5、病毒作用还需进一步验证。